儿童重症手足口病细胞因子变化研究

王晓冬 霍习敏 徐梅先 张银瑞 耿文锦 曹丽静 孙慧 郭艳梅 李君娥 康磊

手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的以口腔疱疹及手足皮疹为突出表现的小儿传染性疾病。实质为病毒感染脓毒症，细胞因子作用下，很快出现多脏器功能损害，往往危重症出现肺出血，直接危及生命。神经源性肺水肿(neurogenic pulmonary edema，NPE)的发病机制目前尚未能明确，冲击伤理论和渗透缺陷理论一直被试图用来解释NPE。但是这些理论尚不能完全解释肠道病毒71(enterovirus71，EV71)相关性肺水肿，EV71感染后的NPE发病机制可能与多种因素有关。其中，细胞因子和趋化因子可能在肺水肿的发病机制中起重要作用［1］。本研究采用前瞻性病例设计，对我院重症监护科手足口病患儿血白介素(IL-4、IL-6、IL-10及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平进行检测，并对比四项指标在EV71感染患儿中的差异，探讨多种细胞因子HFMD病情进展的关系，及EV71阳性病例在病程过程中是否具有更加明显的免疫反应。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采集2013年3月至11月我院重症医学科收治的手足口病重型患儿98例，男48例，女50例;年龄2个月至7岁，平均年龄26月;其中年龄＜1岁18例，1～3岁60例，3～7岁20例。病例全部合并病毒性脑炎，合并下呼吸道感染29例。根据临床特征和并发症情况分为重症组(n=52)和危重症组(n=46)。对照组为健康儿童50例，男25例，女25例，平均年龄26个月。3组年龄构成及性别组成差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究符合医学伦理学标准，经医学伦理委员会批准，所有治疗获得患儿家属的知情同意。

1.2 纳入及分组诊断标准:(1)HFMD诊断标准:按照我国卫生部印发的《手足口病诊疗指南2010年版》的临床诊断标准［2］。(2)重型HFMD诊断标准:出现神经系统受累表现。如精神差，嗜睡、易惊、谵妄，头痛、呕吐，肢体抖动，肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍，无力或急性弛缓性麻痹，惊厥。体征可见脑膜刺激征，腱反射减弱或消失。(3)HFMD危重型诊断标准:①频繁抽搐、昏迷、脑疝;②呼吸困难、发绀、血性泡沫痰、肺部啰音等;③休克等循环功能不全表现出现。上述情况之一即可诊断HFMD危重症。排除既往有肝肾功能不全、血液系统疾病及先天性疾病患儿。

1.3 方法 HFMD重症组及危重症组患儿入院后立即取静脉血2 ml，行 IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 等指标检测。留取标本前患儿均未接受抗凝和抗血小板聚集药物治疗，亦为接受鲜血、血浆制品治疗。详细记录患儿重症监护内容。

1.4 检测方法 患儿入院后24 h内采集外周静脉血3 ml，分离血清置于－80℃冰箱待测。采用双抗体夹心ELISA法检测细胞因子，试剂购自武汉华美生物工程有限公司。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以采表示，采用t检验;多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床表现 重型组52例，有发热、皮疹、神经系统受累，主要表现为嗜睡、易惊、肢体抖动、阵发性抽搐等。危重型组46例，均表现为高热(体温39.0℃以上)，病程1～6 d;患儿入院时病情较危重，出现频繁抽搐和严重意识障碍，同时伴有循环系统和呼吸系统受累表现，其中12例死亡病例，均出现神经源性肺水肿，死于呼吸循环衰竭。

2.2 辅助检查 患儿均行病原学检查。病例均于入院当天查EV71咽拭子分泌物PCR检查，检出EV71阳性57例，其中重症22例(42.3%)，危重症35例(76.0%);阴性者 41例，阳性病例占总病例数58.1%。血清多重细胞因子水平结果:重症组52例，危重型组46例。与对照组比较，重症组IL-6、IL-10和TNF-α明显升高(P＜0.05);危重症组中的 IL-6和TNF-α与重型组和对照组比较，均显著升高(P＜0.01，P＜0.01);IL-4 及 IL-10 对照组比较，均显著升高(P＜0.01)，但与危重组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。EV71阳性组(56例)与病原学未检出组(42例)比较，IL-4轻微升高，差异无统计学意义(P＞0.05);IL-6、IL-10 和 TNF-α 明显升高(P＜ 0.05)。见表1、2。

表1 3组血清细胞因子水平比较ng/ml，±s

表1 3组血清细胞因子水平比较ng/ml，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与重症组比较，#P ＜0.05

指标 对照组(n=50)重症组(n=52)危重症组(n=46) F值 P值IL-4 13±5 28±14 52±12*#5.128 ＜0.05 IL-6 37±12 62±6 97±24*# 11.762 ＜0.01 IL-10 47±14 146±30* 188 ±62* 15.144 ＜0.01 TNF-α 117±43 201±75* 319±117*#16.149 ＜0.01

表2 重症HFMD血清细胞因子比较ng/ml，±s

表2 重症HFMD血清细胞因子比较ng/ml，±s

注:与EV71阳性组比较，*P ＜0.05

指标 EV71阳性组(n=56) EV71阴性组(n=42)IL-4 52±12 37±20 IL-6 84±43 39±17*IL-10 154±59 99±36*TNF-α 240±135 107±84*

3 讨论

手足口病为肠道病毒感染所致，近年来有关肠道病毒71型感染的报道日益增多，而且成为亚洲及我国南方地区手足口病流行主要病原体并引起暴发流行［3］。近年来在北方也不少见，河北也呈群发态势。重症手足口病多由EV71病毒感染引起，病情凶险，病死率高。其发病时即有高热持续不退，但经常皮疹隐匿，病情可瞬时突变，很快出现以神经、呼吸和心血管系统障碍为主的临床表现。国内外研究发现患者体内白细胞总数升高、高血糖、白细胞介素及肿瘤坏死因子等细胞因子升高，表明其发病机制可能与应激、全身炎性反应(SIRS)有关［4］。手足口病患儿病情发展过程中是否有炎性反应参与，在其发病机制中的作用如何引人关注［5］。本研究对重症手足口病细胞因子水平进行分析，显示，重症手足口病患者促炎因子(TNF-α及IL-6)及抗炎因子(IL-4、IL-10)均有升高，说明手足口病作为病毒感染的脓毒症存在着严重炎性因子释放。发病极期体内 IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 等细胞因子分泌均增高，表明病毒可能在机体内引起严重的应激和全身炎性反应，这些细胞因子活化后激活其他效应细胞，促进其他炎性因子释放，引起连锁反应及放大效应即瀑布效应引起SIRS，临床表现为多脏器功能障碍综合征(MODS)［6］，大量的动物实验表明细胞因子成为 MODS 的标志［7］。

病毒进入机体，抗原诱导初始T细胞分化为辅助性T细胞(主要包括Th1、Th2等)及调节性T细胞。Th1细胞主要分泌TNF-α等细胞因子，Th2细胞分泌IL-4等，主要诱导细胞免疫反应;协助B细胞产生抗体［8］。淋巴细胞及单核细胞均可产生IL-6，有研究发现脑星形胶质细胞、下丘脑和垂体前叶也能自分泌诱导IL-6，TNF-α可刺激 IL-6的分泌能力增加［9］。研究表明，IL-6诱导巨噬细胞和内皮细胞产生多种炎性因子和趋化因子参与炎性反应［10］。调节性T细胞可通过细胞接触机制或细胞因子(分泌IL-10等)抑制过度免疫反应。其中TNF-α、IL-6促炎因子，IL-4及IL-10为抗炎因子，促炎因子与抗炎因子的双向作用，使病情变得复杂。

以往认为SIRS早期主要产生TNF-α、IL-1β等炎性细胞因子，激发炎性反应，随后机体启动代偿性抗炎反应机制，IL-10等抗炎因子产生以对抗过度产生的炎性因子。有研究注意到SIRS早期患者可表达高水平促炎因子的同时也有抗炎因子如IL-10等超高水平的表达［11］。本研究验发现，重症患儿体内促炎因子如TNF2α、IL-6及抗炎因子IL-10分泌也高于对照组，提示手足口病重型已经存在免疫抑制和免疫亢进，危重型患儿促炎因子明显高于重型，而抗炎因子无明显差异，说明机体免疫失衡导致复杂的免疫紊乱。抗炎因子的分泌后不能随促炎因子升高而升高，说明炎症控制减弱，从而病情加重。所以，重症患儿给予糖皮质激素及免疫球蛋白抑制多种促炎因子及抗炎因子，可在一定程度上阻断SIRS的瀑布效应，临床治疗的重要手段。

手足口病重型进展为危重型的过程与脑干炎症后植物神经功能失调或交感神经功能亢进有关，有观点认为EV71感染后免疫新损伤是发病机制之一［12，13］。病原体检测阳性是HFMD患儿的确定诊断标准。极少数重症病例皮疹不典型，临床诊断困难，需结合病原学或血清学检查做出诊断［14］。本研究结果显示，EV71检测阳性患儿血清内细胞因子水平显著增高，提示活跃的病毒在体内表现出更加显著的免疫反应。促炎因子及抗炎因子在EV71检测阳性患儿中明显升高，进一步验证了炎症风暴在EV71感染机制中的作用。

本研究通过观察重症手足口病患儿细胞因子水平，了解促炎因子及抗炎因子在病毒性脓毒症中的变化特点，给临床工作提供了理论基础。同时，帮助临床工作早期识别重症病例，迅速采取相应措施，从而减少重症手足口病的病死率。

1 黄小霏，范联，陈国华.手足口病患儿血清IL-6、IL-10、IL-17水平的变化及其临床意义.重庆医学，2012，41:3157-3159.

2 中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南(2010年版).

3 钱素云.手足口病在中国大陆的流行现状及诊治进展.中国小儿急救医学，2011，18:1-3.

4 Castillo L.High elevated ferritin levels and the diagnosis of HL H/Sepsis/SIRS/MODS/MAS.Pediatr Blood Caner，2008，5:710-711.

5 黄少华，韦丹，钱程.手足口病患儿血清细胞因子检测及意义.中国小儿急救医学，2013，20:484-486.

6 金伯泉主编.医学免疫学.第5版.北京:人民卫生出版社，2008.65.

7 Takala A，Jonscla I，Jansson SE，et al.Markérs of systemicinflammation predicting organ failure in commuity-acquired septic shock.Clin Sci，1999，97:529-538.

8 Chen LC，Yeh TM.Enterovirus 71 infection of human immune cells induces the production of proinflammatory cytokines.J Biomed Lab Sci，2009，21:82-87.

9 Wang SM，Lei HY，Huang KJ，et al.Pat hogenesis of enterovirus 71，brainstem encephalitis in pediat ric patients:roles of cytokines and cellular immune activation in patients with pulmonary edema.Infect Dis，2003，188:564-570.

10 McGeachy MJ，Cua DJ.T cells doing it for themselves:TGF-beta regulation of Th1 and Th17 cells.Immunity，2007，26:547-549.

11 付丹，李成荣，何颜霞，等.婴幼儿脓毒血症不同免疫状态细胞因子变化探讨.中国小儿急救医学，2009，40:108-109.

12 中华人民共和国卫生部.肠道病毒71型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识(2011年版).

13 闫春明，耿蓉娜.2010至2012年重症手足口病流行特征分析.河北医药，2014，36:429-431.

14 Chen LC，Yeh TM.Enterovirus 71 infection of human immune cells induces the production of proinflammatory cytokines.J Biomed Lab Sci，2009，21:82-87.