甜高粱酿酒酵母耐受性分析

薛 梅，张晓双，段开红，田瑞华

(内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018)



甜高粱酿酒酵母耐受性分析

薛 梅，张晓双，段开红，田瑞华

(内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018)

[目的] 分析4株甜高粱酿酒酵母菌的耐受性。[方法]研究了4株发酵工程实验室保存的甜高粱酵母菌和1株商业酵母菌对乙醇、蔗糖、酸、碱、渗透压的耐受性，通过观察在这4种因素下菌落的生长情况，对其耐受性进行分析。[结果]试验表明，4株甜高粱酵母菌均表现出不同的耐受性，在不同的胁迫环境下均表现出较强的抗胁迫能力。[结论]研究可为利用甜高粱秸秆进行乙醇发酵的菌种选择提供参考依据。

甜高粱；酿酒酵母；耐受性

在传统不可再生能源日益匮乏的今天，具有可再生能力的清洁能源起到越来越重要的作用。作为可再生清洁能源的一种，生物质能源也以惊人的速度发展。甜高粱是主要的生物质能源，而且甜高粱秸秆中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量很高，经粉碎后可直接发酵生产乙醇[1]。甜高粱的适应性较强，可以在全国大部分地区种植，甜高粱有抗旱、耐涝、耐盐碱、耐瘠薄、耐高温和寒冷等特性[2]。同时甜高粱是所有生物质能源品种中，投入最低、风险最小、产业链最长、适应区域最广、产出最高的生物能源乙醇的作物品种[3]。甜高粱秸秆营养价值高，可作饲料、酿酒、生产乙醇等，其作为新能源作物，具有极大的开发价值。

笔者研究了4株发酵工程实验室保存的甜高粱酵母菌和1株商业酵母菌对乙醇、高糖、酸碱、渗透压的耐受性，以期为内蒙古特殊地区甜高粱秸秆生产乙醇提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。内蒙古农业大学发酵工程实验室经过10年的甜高粱汁特定培养基驯化培养的菌种71b、90#、Hc、X7、Hb、AQ、Ba、Bc、120S、MO，作为供试菌种。市场销售的商业酵母菌为安琪的高活性酿酒干酵母。

1.1.2 主要试剂。葡萄糖、细菌学蛋白胨、酵母提取物为生化级试剂，无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸、蔗糖、氯化钠为分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器。手持糖度计、恒温培养箱、超净台、pH计、显微镜、血球计数板。

1.1.4 甜高粱汁培养基。甜高粱汁，锤度为2左右，用蒸馏水和蔗糖调节。

1.2 方法1.2.1

酵母菌数的测定。每个试管移入5 ml甜高粱汁培养基，置于28 ℃的条件下培养。分别在12 h后、24 h后以血球计数法测定总菌数和出芽率。通过美兰染色测定死亡率[4-5]。

1.2.2 乙醇耐受性的测定。每个试管移入10 ml甜高粱汁液体培养基，培养基中乙醇的浓度分别为10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%[6-7]。接种量为10%，28 ℃培养40 h后，移取菌液点种于固体培养基上，在28 ℃的培养箱中培养24～48 h，观察并记录。

1.2.3 耐糖度的测定。每个试管移入10 ml甜高粱汁液体培养基，培养基中蔗糖的浓度分别为300、400、500、600、650、700、750、800 g/L[8]。接种量为10%，28 ℃培养40 h后，移取菌液点种于固体培养基上，28 ℃的培养箱中培养24～48 h，观察并记录。

1.2.4 耐酸碱的测定。每个试管分别移入10 ml 用盐酸和氢氧化钠调整pH至1.0、1.5、2.0、3.0、10.0、11.0、12.0、12.5、13.0[9-10]培养基。将菌种接入培养基中，接种量为10%，28 ℃培养40 h，移取菌液点种于固体培养基上，28 ℃培养，24～48 h后观察并记录。

1.2.5 耐渗透压的测定。配制固体甜高粱汁培养基，培养基中NaCl的浓度分别为180、200、220、240、260、280、300、320、340、360 g/L[11-12]。将已活化好的菌液点种于培养基上，在28 ℃的培养箱中培养72 h，观察并记录。

2 结果与分析

2.1 总菌数和出芽率的测定结果

分别对培养12及24 h后总菌数、出芽率的测定结果进行分析。由图1～4可知，以菌种AQ为参照，出芽率在15%～30%[4]，死亡率<0.5%，在短时间内能达到7.0×107CFU/ml的菌株。试验表明，以上试验的死亡率均小于0.5%。最终菌种90#、Hb、71b、120S相对较符合要求。对这4株菌和AQ的耐受性进一步分析。

2.2 耐乙醇的测定结果

乙醇对细胞的抑制作用很复杂，主要表现在抑制酵母的增殖速度、存活性和发酵力3个方面[13]。酵母菌的生长会随着乙醇浓度的增加而减弱。表1可得，在乙醇含量为24%时各菌种仍然能够生长，所以这5株菌都表现出了良好的乙醇耐受性。在乙醇含量为16%～18%时，对这5株菌的生长开始产生毒害作用。

表1 耐乙醇试验结果

注：“+++”表示生长良好，“++”表示生长一般，“+”表示生长菌落少，“-”表示不生长。

2.3 耐酸碱的测定结果

从表2中可知，5株菌对酸碱均表现出不同的耐受性，菌株90#、71b在pH是1.0的强酸性环境中仍能生长，其他菌在pH为3.0左右时大多数出现抑制。Hb对碱性环境的耐受性是11.0，其他均是12.0。但是在pH是10.0时，菌株90#、Hb的菌株已出现生长抑制现象。这5株菌都表现出较强的耐酸、耐碱能力。

表2 耐酸碱的试验结果

注：“+++”表示生长良好，“++”表示生长一般，“+”表示生长菌落少，“-”表示不生长。

2.4 耐糖度的测定结果

蔗糖不仅是甜高粱发酵生产乙醇的主要基质，也是酵母赖以生活的能源物质。但是高浓度的糖对酵母生长有抑制作用，而且，高渗透压会导致酵母细胞水分流失，水活性降低[8]。从表3中可以看出，5株酵母菌均表现出良好的耐高糖特性，5株菌在糖浓度为750 g/L的高糖浓度下均能生长，所以5株菌的耐糖度都达到750 g/L。在糖浓度为700 g/L时，对90#菌株的生长有了抑制作用。在糖浓度为800 g/L时，完全抑制了这5株菌的生长。

2.5 耐渗透压的测定结果

从表4中可以看出，这5株酵母菌对于渗透压均表现出较高的耐受性，在NaCl浓度为360 g/L时依然生长。原因可能是20 ℃时，盐饱和度为36%，而凝固后温度降低，培养基中出现细小晶体，所以固体培养基中NaCl浓度达不到36%，而且在固体培养基上的菌落很细小，所以这5株菌在高盐胁迫下仍然能生长。

表3 耐糖度的试验结果

注：“+++”表示生长良好，“++”表示生长一般，“+”表示生长菌落少，“-”表示不生长。

表4 耐渗透压试验结果

注：“+++”表示生长良好，“++”表示生长一般，“+”表示生长菌落少，“-”表示不生长。

3 结论

试验研究了以甜高粱茎汁为原料发酵制取乙醇的5株酿酒酵母菌，测量酵母菌细胞数、出芽率和酵母菌的耐受性。通过酵母的细胞数和出芽率得出，AQ、Hb、120S和71b符合生产应用，而90#发酵后会产生特殊香味，有待进一步的研究。

经过以上5株酿酒酵母的耐受性试验，结果表明：这5株酵母菌受到乙醇的毒害耐受上限为24%。AQ、90#、71b、120S菌株的耐酸能力达到pH 1.5，Hb的耐酸特性为2.0；AQ、90#、71b、120S菌株的耐碱达到12.0，Hb菌株的耐碱达到11.0。5株菌的耐糖度都达到750 g/L。5株菌在NaCl浓度为360 g/L时依然生长。

这5株菌对乙醇、糖、盐、酸和碱的耐受性较高，为内蒙古部分特殊盐碱地区利用甜高粱秸秆发酵生产乙醇提供了参考。此研究对于在特殊环境条件下工业生产中酵母菌的选择具有重要意义。

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[3] 赵立欣,张艳丽,沈丰菊.能源作物甜高粱及其可供应性研究[J].可再生能源,2005(4):37-40.

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[6] 魏立杰,田瑞华,段开红，等.11株野生沙棘酵母菌株的耐受性分析[J].酿酒,2013(3):36-38.

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[8] 薛军侠.酿酒酵母的筛选鉴定及耐受性初步研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2007.

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[13] 李雪雁，赵华.酒精发酵副产物对酵母菌生长的影响[J].酿酒,2001(6):58-60.

Analysis of Tolerance of Yeast from Sweet Sorghum Stalk

XUE Mei, ZHANG Xiao-shuang, DUAN Kai-hong et al

(College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010018)

[Objective] To analyze tolerance of four yeasts from sweet sorghum stalk. [Method] Tolerance of four yeasts from sweet sorghum stalk and one commercial yeast to alcohol, sugar, acid and alkali, and osmotic pressure was researched in this study. Tolerance assay was observed by the colony growth under five treatments. [Result] Results showed that these four yeasts all exhibited high survival rate and different resistance level to various stresses. [Conclusion] This study provides a valuable reference for future studies on the stains selection for the fermentation of sweet sorghum stalk.

Sweet sorghum; Yeast; Tolerance

薛梅(1990-)，女，内蒙古乌兰察布人，硕士研究生，研究方向：发酵工程技术应用。

2015-11-11

S 188+.4

A

0517-6611(2015)35-145-03