骨髓增生异常综合征患者循环m icroRNA-144的检测及其临床意义

饶燕飞 ，刘静 ，章海斌 ，姚心韵 ，丁伟荣

(1、南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌330006；2、四川大学华西口腔医学院2010级，四川 成都 610041；3、江西省人民医院血液科，江西 南昌330006)

骨髓增生异常综合征 (myelodysplastic syndromes，MDS)是一组异质性克隆性造血干细胞疾病，表现为难治性的一系或多系血细胞减少，因其具有高风险向急性白血病转化的特征而严重危害人们的生命健康。临床上，MDS的诊断分型与预后判断主要基于病理学和细胞遗传学特征，如骨髓原始细胞数、染色体组型和外周血细胞减少程度等。最近研究发现，MDS患者外周血循环microRNAs对疾病的诊断和预后亦有良好鉴别效果，尤其是在预后判断方面，let-7a和miRNA-16的准确性已超过常用预后评分系统[1]。

近年研究证实，miRNA-144在造血系统中发挥了重要的调控作用，参与红系细胞的分化调节[2]，促进慢性髓系白血病的发生发展[3]，影响急性髓系白血病预后[4]。但其与造血系统异常的MDS的相关性尚无相关研究提及，本研究将就miRNA-144在MDS中的表达情况及其临床意义做一初步探讨。

1 资料与方法

1.1 病例资料 收集南昌大学第二附属医院2011年3月至2013年12月间确诊的MDS患者，分型标准参照世界卫生组织(TheWorld Health Organization,WHO)2008年分型诊断标准。共纳入MDS病例24例，同时收集12例健康志愿者作为对照组。所有研究对象均收集EDTA抗凝全血3ml，离心取血浆备用。纳入标准：(1)首次就诊，未经任何治疗；(2)分别经形态学及病理学确诊；(3)未合并其它血液系统疾病。排除标准：(1)诊断或分型不明确者；(2)合并其它严重消耗性疾病者。

1.2 microRNA检测 取500μl血浆，使用Trizol(Invitrogen)提取总RNA，溶解于DEPC处理过的蒸馏水中，检测OD260/OD280及浓度，取合格样本应用Takara逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA进行qRT-PCR。miRNA-144及U6内参引物序列如下：miRNA-144 正 向 ：5’-GCT GGG ATA TCA TCA TAT ACT G-3’， 反向：5’-CGG ACT AGT ACA TCA TCT ATA CTG-3’；U6 正 向 ：5’-CTC GCT TCG GCA GCA-3’；反向：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。 QRT-PCR反应 在 ABI7500 PCR仪上进行，反应体系为20μl，含cDNA 1μl，Takara SYBR Green IMastermix(2×)12.5μl， 引物各0.5μl，ROX Reference Dye(50×)0.4μl，dH2O 5.1μl。反应条件为：95℃变性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，以U6表达量为内参照标准，根据双Delta法[5]计算miRNA-144的相对表达量，计算公式为：

(1)基因相对表达量=2-ΔΔCt；

(2)ΔΔCt=(CtmiRNA-CtU6)MDS-(CtmiRNA-CtU6)control。

1.3 统计分析 qRT-PCR每次测定均设置3个复孔，结果以均数±标准差(x±s)表示，以 REST 2009软件辅助分析。两样本均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义，统计分析应用SPSS v19.0完成。

2 结果

2.1 病例特征 对照组为12例健康体检者，其中男、女各6例，年龄20~70岁，中位年龄52岁。纳入的24例MDS患者男13例，女11例，年龄31~79岁，中位年龄64.5岁，其余临床特征见表1。

表1 24例MDS病例资料

2.2 miRNA-144在MDS中的表达 根据双Delta法计算miRNA-144的相对表达量 (即MDS中miRNA-144表达量相对于对照组miRNA-144表达量的倍数)，健康对照组表达量为1，MDS组相对表达量为 5.07±2.38，MDS各亚组表达量见图 1，RCUD、RCMD、RARS、RAEB-1 及 RAEB-2 各 组miRNA-144的相对表达量分别为3.81±1.46、3.64±1.30、4.56±0.18、6.49±2.01 及 8.73±2.80， 均显著高于健康对照组，P＜0.01。

图1 MDS中m iRNA-144的相对表达量

2.3 miRNA-144与MDS预后 依据MDS的WHO分型预后积分系统(WPSS)，本研究将MDS类型归为预后好类，包括RCUD、RCMD和RARS型，和预后差类，包括RAEB-1和RAEB-2型。miRNA-144在预后好和预后差组中的相对表达量分别为3.81±1.23和7.18±2.38，差异具有统计学意义，P<0.01，结果见图 2。

图2 m iRNA-144相对表达量与MDS预后相关

3 讨论

miRNA是广泛存在于动植物中的一类内源性小分子单链非编码RNA，其通过整合入基因沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)特异性识别和结合目的mRNA的3′端非编码区或者直接降解mRNA而抑制靶mRNA的翻译，调控基因的表达，miRNA认为是基因表达转录后微调节的重要机制，其在细胞增殖、分化和死亡中起重要作用，并参与生物学进程的所有方面[6]。

MDS的发病机制十分复杂，涉及遗传不稳定性、造血干祖细胞功能异常、免疫监视功能受损和骨髓微环境异常等。目前，众多研究已经证明microRNAs与血细胞的增殖分化[7]及MDS的发生发展密切相关，且在不同类型和危险度的MDS患者体内呈特征性表达[8,9]。我们的研究显示，miRNA-144在MDS中的表达量显著高于正常对照组，且分类统计显示，所有类型MDS的miRNA-144的升高均有统计学意义，说明miRNA-144升高在MDS中具有一定的普遍性，这提示我们，miRNA-144与MDS具有一定相关性。查阅文献发现，miRNA-144能调节早期红细胞的成熟和增生，敲除miRNA-144能显著降低红系细胞的分化成熟能力，并且miRNA-144在应激条件下调节基因表达对于稳定红细胞生成至关重要[2，10]，由此我们推测，MDS中miRNA-144的高表达状态很可能是红系代偿性增生的结果，当然，鉴于miRNAs靶基因的多样性及其功能的复杂性，miRNA-144在MDS中的高表达可能还有其它原因，这有待于进一步研究证实。

另一方面，我们的研究显示，在MDS亚型RAEB-1和RAEB-2中，miRNA-144的升高程度显著高于 RCUD、RCMD和 RARS亚型。根据WPSS预后评分系统，RAEB-1和RAEB-2属于高危因素，而RCUD、RCMD和RARS相对属于低危因素，这提示我们，miRNA-144的表达量可能有助于MDS的预后判断。目前，miRNAs作为新兴的疾病诊断、预后分子标志物已得到大量研究证实[11-15]，其中let-7a和miRNA-16已被证实当其用于MDS预后评估时，其准确性已超过常用预后评分系统[1]。鉴于此，我们将继续研究miRNA-144对MDS的预后判断能力，以期发现新的MDS预后评估分子标志物。

[1]Zuo Z,Calin GA,de Paula HM,et al.Circulating microRNAs let-7a and miR-16 predict progression-free survival and overall survival in patients with myelodysplastic syndrome [J].Blood,2011,118(2):413-415.

[2]Bianchi N,Zuccato C,Finotti A,et al.Involvement of miRNA in erythroid differentiation[J].Epigenomics,2012,4(1):51-65.

[3]Machova PK,Lopotova T,Klamova H,et al.Expression patterns of microRNAs associated with CML phases and their disease related targets[J].Mol Cancer,2011,10(1):41.

[4]Whitman SP,Maharry K,Radmacher MD,et al.Flt3 internal tandem duplication associates with adverse outcome and gene-and microRNA-expression signatures in patients 60 years of age or older with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia:A cancer and leukemia group study [J].Blood,2010,116(18):3622-3626.

[5]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[6]Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[7]Zhao H,Kalota A,Jin S,et al.The c-myb proto-oncogene and microRNA-15a comprise an active autoregulatory feedback loop in human hematopoietic cells[J].Blood,2009,113(3):505-516.

[8]Hussein K,Theophile K,Busche G,et al.Significant inverse corre

lation of microRNA-150/MYB and microRNA-222/p27 in myelodysplastic syndrome[J].Leuk Res,2010,34(3):328-334.[9]Starczynowski DT,Kuchenbauer F,Argiropoulos B,et al.Identification of miR-145 and miR-146a asmediators of the 5q-syndrome phenotype[J].NatMed,2010,16(1):49-58.

[10]Yu D,dos Santos CO,Zhao G,et al.MiR-451 protects against erythroid oxidant stress by repressing 14-3-3zeta [J].Genes Dev,2010,24(15):1620-1633.

[11]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection [J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

[12]Grasedieck S,Sorrentino A,Langer C,et al.Circulating microRNAs in hematological diseases:principles,challenges,and perspectives[J].Blood,2013,121(25):4977-4984.

[13]Vasilatou D,Papageorgiou SG,Kontsioti F,et al.Expression analysis ofmir-17-5p,mir-20a and let-7amicroRNAs and their target proteins in CD34+bonemarrow cells of patientswith myelodysplastic syndromes[J].Leuk Res,2013,37(3):251-258.

[14]Schanz J,Tuchler H,Sole F,et al.New comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes(MDS)and oligoblastic acutemyeloid leukemia after MDS derived from an international databasemerge[J].JClin Oncol,2012,30(8):820-829.

[15]Nybakken GE,Bagg A.The genetic basis and expanding role of molecular analysis in the diagnosis,prognosis,and therapeutic design formyelodysplastic syndromes[J].JMol Diagn,2014,16(2):145-158.