牛脾脏粗提物的抗菌活性分析

张冰清,杭柏林,夏一赫,魏晓晓,杨雪峰,胡建和

(河南科技学院,河南新乡453003)

牛脾脏粗提物的抗菌活性分析

张冰清,杭柏林,夏一赫,魏晓晓,杨雪峰,胡建和

(河南科技学院,河南新乡453003)

为获得具有抗菌作用的物质,研究对牛脾脏粗提物进行了提取,并通过抑菌试验检测了粗提物对几种革兰阳性菌和革兰阴性菌的抑菌活性.结果表明：牛脾脏粗提物对产气肠杆菌和变形杆菌具有较好的抑菌活性,但对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌(疫苗株)没有明显抑制作用.牛脾脏粗提物中存在着抗菌活性物质.

牛脾;粗提物;抗菌活性;分析

牛是我国重要的经济动物.但是,目前细菌性、病毒性和寄生虫性传染病一直威胁着动物的健康,进而阻碍了我国养牛业的发展,也影响着国民经济增长[1].抗生素和疫苗在预防动物传染病方面发挥了重要作用.但是近年来,由于药物的滥用,药物残留和细菌耐药性等问题日渐严重,不仅一直困扰着养殖业,而且引发了人们对食品安全的关注,给人类的健康带来潜在的威胁[2].因此,要选择其他替代物来预防和治疗动物传染病.动物的天然免疫系统中有很多的先天抗病原分子,如补体分子、干扰素、限制因子、溶菌酶、抗菌肽等[3-4],因此,从动物体内寻找天然分子用于动物传染病的预防和治疗是一个很有前景的选择[5-6].脾脏是动物的外周免疫器官,是发挥贮血、滤血和免疫应答等功能的器官.脾脏中有很多免疫细胞,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等[7-8],由这些细胞所合成与分泌的物质具有抵抗外来病原微生物的功能,从而保障机体健康.所以,从脾脏中分离具有抗菌活性的物质具有重要的理论意义和临床实践意义.

为此,本研究拟从牛脾脏中提取具有抗菌活性的物质用于动物传染病的预防和治疗,为养殖业的发展提供帮助.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 牛脾脏来源 无菌操作采集河南省卫辉市世魁牛肉清真屠宰场检验员确认为无传染病感染的牛的新鲜脾脏,于4～10℃冷藏条件下运至河南科技学院动物科学学院的预防兽医学实验室,放入-80℃冰箱中保存,备用.

1.1.2 细菌来源 研究所用细菌包括大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、产气肠杆菌和炭疽杆菌(疫苗株),由河南科技学院动物科学学院的预防兽医学教研室保存.

1.1.3 常规试剂 蛋白胨(上海汇合生物科技有限公司)、牛肉膏(长葛沃凯德食品配料有限公司)、营养琼脂(广州市鸿洲实验器材科技有限公司)、无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)、氯化钠(义乌市安格医疗器械有限公司)、香柏油(长沙市裕丰化玻器械有限公司)、二甲苯(青岛正华化工有限公司)、革兰染色试剂盒(丽水市中益生物技术有限公司)、亚甲基蓝(博湖生物有限公司)、冰乙酸(郑州三联商贸有限公司)等均为试验常规试剂.

1.1.4 大中型仪器 超低温冰箱(Thermo)、普通冰箱(博西华家用电器有限公司)、生物显微镜(淄博森源电气有限公司)、水平振荡仪(国华电器有限公司)、高压蒸馏灭菌器(Hirayama)、超净工作台(苏州市金净净化设备科技有限公司)、天平(sartorius)、微量移液器(eppendorf)、干烤箱(上海一恒科学仪器有限公司)、生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、高速冷冻离心机(Thermo)、纯水仪(Thermo)、紫外分光光度仪(BioDrop)、旋转蒸发仪(上海雅东玻璃制品有限公司)、冻干机(青岛永合创信电子科技有限公司)、制冰机(SANYO)、组织匀浆机(T18 basic)、超声破碎仪(南京新辰生物科技有限公司)、SHZ-D(III)型循环水真空泵(河南省金博仪器制造有限公司)等均为实验室常规仪器.

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备 培养细菌的培养基为营养琼脂培养基(牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,琼脂20 g,NaCl 5 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.2～7.4)和营养肉汤(牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,氯化钠5 g,磷酸二氢钾5 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.2～7.4),121℃灭菌20 min.制备过程按文献[9]进行.

1.2.2 牛脾脏粗提物的制备 按照文献[5-6]制备牛脾脏粗提物.制备过程简述如下:将脾脏从-80℃冰箱中取出,室温下解冻;去除表皮包膜;加入适量质量分数为0.9%的生理盐水,搅匀后组织匀浆;细胞破碎(破碎仪调至超声8 s,间隔4 s,35%Amp,15 min);加入质量分数为5%的乙酸,冰浴中搅拌6 h;低温离心,8 000 r/min、30 min、4℃;取上清,混合,放于4℃冰箱;沉淀混合后,重复搅拌、离心;混合所有上清,45℃旋转蒸发6～8 h;冻干,然后-80℃保存.使用时,用灭菌去离子水稀释,用紫外分光光度仪测定蛋白浓度.

1.2.3 细菌悬液的制备 将6种受试细菌分别接种营养肉汤,37℃培养12 h,取细菌培养液按文献[10]的方法进行细菌计数.然后用灭菌生理盐水将6种受试细菌均调整菌落浓度为1.0×106CFU/mL.

1.2.4 抗菌活性检测 采用药敏纸片法[11]检测牛脾脏粗提物的抗菌活性.按文献[12]的方法制备灭菌纸片.抗菌活性检测过程简述如下:在超净工作台上,将50 μL计数的细菌悬液置于营养琼脂培养基上,用灭菌"L"形玻璃涂棒将细菌涂布均匀;用灭菌镊子取灭菌纸片贴到培养基表面,轻按几下;在灭菌纸片上滴10 μL牛脾提取物;然后置于37℃培养24 h,观察结果并测定抑菌圈直径.

2 结果与分析

2.1 牛脾脏粗提物的制备

冻干后的牛脾脏粗提物用灭菌去离子水溶解后,通过紫外分光光度仪测定的质量浓度为5.36 g/L.

2.2 牛脾脏粗提物抗革兰阳性菌结果

经抗菌活性检测发现,牛脾脏粗提物对金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌(疫苗株)没有形成抑菌圈.这表明,牛脾脏粗提物对这2种革兰阳性菌没有抗菌作用.

2.3 牛脾脏粗提物抗革兰阴性菌结果

牛脾脏粗提物抗革兰阴性菌结果如表1所示.牛脾脏粗提物对变形杆菌和产气肠杆菌有抗菌活性,形成了明显的抑菌圈(如图1所示);但牛脾脏粗提物对沙门菌和大肠杆菌没有抑制作用.

表1 牛脾脏粗提物抗革兰阴性菌结果Tab.1 Results of crude extraction from bovine spleen against Gran negative bacterium

图1 牛脾脏粗提物对产气肠杆菌和变形杆菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of crude extraction from bovine spleen against Enterobacter aerogenes and Proteus

3 讨论

脾脏中有很多的免疫活性细胞,是识别和清除病原微生物的主要器官[3,8].本研究获得的牛脾粗提物有抗菌活性,表明牛脾脏粗提物中存在着抗菌活性物质.但是,牛脾脏粗提物的抑菌作用有选择性(对某些细菌有活性,对某些细菌却没有活性).这种选择性可能有几个原因[12-15]:(1)抑菌物质的浓度,抑制细菌所需要的抑菌物质需要有最低的浓度,本研究选择了不同的细菌和真菌,抑制这些细菌就需要不同的浓度,而本研究中却仅采用了一种浓度,这也可能是有些细菌没有抑菌活性结果的原因;(2)细菌的浓度,细菌浓度越高,抑制其生长所需要的抑菌物质浓度也相应增加,而在本研究中,没有对细菌的浓度进行测定,在进行抑菌活性测定时有的细菌浓度明显偏高,而本研究中抑菌物质却仅采用了一种浓度,这可能是某些细菌没有出现抑菌圈的原因;(3)抑菌物质的纯度问题,抑菌物质的纯度高,其抑菌活性会表现得很明显,而在本研究中,抑菌物质是从牛脾脏中得到的粗提物,是一种混合物,其中含有很多的物质,某些物质有抑菌活性,但可能被其他物质所包裹或掩盖,使得对某种细菌的抑菌活性没有表现出来.

目前,我国动物疫病不断发生,老的疫病尚未消灭,新的疫病不断出现.因此,我国动物疫病的预防和控制面临着严峻的考验.抗生素的大量使用和滥用以及药物残留问题一直困扰着人类和动物的健康[16].寻找可用于预防和治疗动物疫病的新型有效药物迫在眉睫.天然提取物具有安全、有效、来源广等优点.利用牛脾粗提物的抑菌活性开发新型的动物疫病治疗药物,在防治动物疾病、生产绿色食品等方面具有广阔的应用前景.

4 结论

本研究证明了牛脾粗提物有抗菌活性,对变形杆菌和产气肠杆菌有抑制作用,但不能抑制金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌(疫苗株)、大肠杆菌和沙门菌的生长.

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（责任编辑：卢奇）

Bacteriostasis analysis of crude extract from bovine spleen

ZHANG Bingqing,HANG Bolin,XIA Yihe,WEI Xiaoxiao,YANG Xuefeng,HU Jianhe
(Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

To gain material which has antibacterial effect,the crude extraction from bovine spleen were carried out, and bacteriostatic experiment tests against several gram-positive bacteria and gram-negative bacteria were performed.The results showed that the crude extract from bovine spleen has bacteriostatic on Enterobacter aerogenes and Proteus,but has no antibacterial activity on E.coli,Salmonella,Staphylococcus aureus and Bacillus anthrax vaccine strain.This indicates that crude extract from bovine spleen has materials which has antimicrobial activity.

bovine spleen;crude extract;antimicrobial activity;analysis

S823

：A

：1008-7516（2015）05-0045-03

10.3969/j.issn.1008-7516.2015.05.010

2015-06-11

国家自然科学基金项目(31372469);河南省科技计划项目(142300410142);河南科技学院研究生创新基金(YCX201402)

张冰清(1989-),女,河南商丘人,硕士生.主要从事动物病原与新兽药的研究.

胡建和(1968-),男,河南辉县人,博士,教授,硕士生导师.主要从事动物微生物研究.