甜菜根腐病生防菌株ASP-15抗菌物质初步分析

甄涛，张颖，张先成，韩笑，商亮（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

甜菜根腐病生防菌株ASP-15抗菌物质初步分析

甄涛，张颖，张先成，韩笑，商亮
（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

通过对甜菜根腐病生防菌株克雷伯氏菌ASP-15抗菌物质进行初步分析，分别对多糖、核酸、蛋白进行提取，采取抑菌试验选出抑菌能力最强的物质。发现抑菌能力最强的物质是蛋白，在pH8.0时活性最高，而在强酸和强碱的环境中活性有所下降，对温度、紫外线照射、蛋白酶不敏感。说明蛋白是生防菌株ASP-15抑菌活性物质，抗菌粗蛋白具有较强的酸碱、紫外线和酶的稳定性。

抗菌蛋白；抑菌活性；稳定性

随着对植物病害防治要求的提高，传统抗生素显现出许多弊端［1］，如容易产生耐受性或抗性菌株，人们的注意力也转移到了一类新的物质抗菌蛋白，其具有广谱、高效性，对病菌不易产生抗性［2］。

1　试验方法

1.1胞外多糖提取

取300m L发酵液5 000r/m in，10m in离心菌体取上清液。用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，调pH值至8.0，加入1.0g固定化蛋白酶，40℃、150rpm震荡100m in。用固定化蛋白酶与Sevage法连用除蛋白：先用固定化蛋白酶处理样品，可以降低蛋白的分子量，有利于蛋白的分离［3］。提取液：氯仿——正丁醇5:1混合，加入氯仿——正丁醇（5:1）剧烈振摇后，6 000r/m in离心10m in后，将液体倒入分液漏斗中，充分振荡，去除有机相和蛋白层，保留水相。反复操作6次，直至蛋白层无黏稠状为止［4］。水相离心取上清液10m L，用3倍体积95%乙醇至终浓度70%，4℃沉淀过夜，离心去除上清液，保留沉淀，获得粗多糖。

1.2总DNA提取

TaKaRa细菌基因组DNA提取试剂盒。

1.3粗蛋白提取

采用硫酸铵盐析法获得抗菌蛋白，取上述发酵上清液100m L，加入硫酸铵至20%饱和度，4℃静置过夜沉淀抗菌蛋白。次日4℃，6 000rpm离心30m in，弃上清［5］。用l/10发酵液体积的0.02mo l/L磷酸缓冲液（pH 7.5）缓冲液悬浮，将悬浮液装入透析袋（PEG8000）中透析除盐，将透析袋内物质用聚乙二醇浓缩10m L，20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%重复上述操作。在4℃、12 000rpm条件下离心5m in，上清即为抗菌蛋白的粗提物。

1.4抗菌蛋白ASP-15稳定性研究

1.4.1pH稳定性

用1mol/LHCl和NaOH调节pH至（从2～14），4℃过夜。将pH调至7.0测定抑菌活性［6］。

1.4.2紫外线稳定性

将抗菌蛋白粗提物在28W紫外灯距离10cm处，分别照射1～9h后测定抑菌活性。

1.4.3蛋白酶稳定性

分别用蛋白酶K、胰蛋白酶和链酶蛋白酶处理，每种酶质量浓度为500μg/m L，37℃处理1 h。对处理后的样品溶液测定抑菌活性。

2　结果与分析

2.1抗菌物质活性测定

蛋白、多糖、核酸粗提物进行抑菌试验，抗菌蛋白粗提物产生的抑菌圈远大于多糖粗提物抑菌圈，核酸不产生抑菌圈。我们选取抑菌能力最强的蛋白进行深入研究。

2.2pH稳定性

抗菌蛋白pH比较稳定，在pH 8.0时活性最高，而在2.0和14.0时活性下降。

2.3紫外线稳定性

该抗菌蛋白对紫外线不敏感，经紫外线照射不失活，对紫外线很稳定。

2.4蛋白酶稳定性

抗菌蛋白用不同的蛋白酶在37℃下处理1h后，对其进行抑菌活性检测，经蛋白酶K、胰蛋白酶和链酶蛋白酶处理后，抗菌蛋白为未经处理的抑菌活性的87.3%、84.4%和82.5%，说明抗菌蛋白对蛋白酶不敏感。

3　结论

分别对蛋白、多糖、核酸进行分离纯化获得其粗提物，通过抑菌试验发现蛋白抑菌能力最强，多糖有抑菌能力很弱，核酸无抑菌能力。抗菌蛋白盐析最佳硫酸铵饱和度为40%。抗菌蛋白对紫外稳定性及蛋白酶不敏感，需对其进行进一步机理研究。

［1］昌华.B-HCH菌株的培养及代谢物的初步研究中目［J］.生物防治，1996，（01）：11-14.

［2］程亮.拮抗细菌的研究进展［J］.江西农业大学学报，2003，（5）.

［3］扈瑞平.沙葱多糖Sevage法除蛋白工艺的研究［J］.内蒙古大学学报，2009，（6）.

［4］光域.硫酸——苯酚定糖法的改进与初步应用［J］.食品科学，2005，（08）：342-346.

［5］谢栋.枯草芽孢杆菌抗菌蛋白X98Ⅲ的纯化与性质［J］.微生物学报，1998，（01）：13-19.

［6］陈海英.拮抗细菌在植物病害防治中的应用及展望［J］.安徽农业科学，2008，（20）：8690-8691.

Prelim inary Analysis of Antim icrobial Substances of Sugarbeet Root rot Biocontrol ASP-15

ZHEN Tao，ZHANG Ying，ZHANG Xian-cheng，HAN Xiao，SHANG Liang
（SchoolofResourcesand Environment，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin 150030，China）

Thispapermade research on beet root rotbiocontrolstrain Klebsiella ASP-15 antimicrobialsubstances. Polysaccharides，nucleic acids，proteinswere extracted，the strongestantibacterial substanceswere selected through inhibition test.Strongestantibacterialsubstance is a protein，thehighestactivity atpH8.0，while in acid and alkali environmentdecreased activity，temperature，ultraviolet radiation，protease sensitive.Protein is biocontrol ASP-15 antibacterialsubstances，anti-bacterialcrude protein hasa strong pH stability，UV and enzymes.

Antifungal protein；Antagonistic activity；Stabilty

S476.1

A

1674-8646（2015）05-0024-02

2015-05-15

甄涛（1986-），男，山东泰安人，学士，研究实习员，主要从事基因工程、生物肥料研究。