大豆浓缩磷脂的马来酸酐酰化改性研究

2015-03-27王向云李桂华严水金尹良胜

河南工业大学学报（自然科学版） 2015年3期

王向云，李桂华*，严水金，尹良胜

(1.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450001；2.浙江中泰爆破科技有限公司，浙江新昌 312500；3.浙江永联民爆器材有限公司永进分公司，浙江兰溪 321100）

0 前言

大豆浓缩磷脂作为一种天然表面活性剂，在很多行业都有广泛的应用，但大豆浓缩磷脂的HLB 值相对比较低，在水中的分散性、乳化性不是很好，热稳定性也差，其应用范围受到一定限制.

国内外对改善大豆浓缩磷脂的亲水性能和磷脂改性有较多的报道[1-3].改性方法有物理法、化学法及酶法.物理改性主要包括：溶剂分提法、膜分离法、有机溶剂沉淀法、金属离子沉淀法、柱色谱分离法和微胶囊化等方法.化学改性是指利用一些化学试剂与磷脂分子中的官能团作用而改性，主要包括：酸碱水解、乙酰化、羟基化、羟酰化、氢化、磺酸化和乙氧基改性等[4-5].酶法改性是指利用特定的脂肪酶或者磷脂酶通过水解或者酯交换反应改变磷脂的组成结构，从而改变其理化性质和功能特性[5].有关以马来酸酐为酰化剂对浓缩磷脂的改性鲜有报道.

本研究在不用任何溶剂作为介质的条件下，以马来酸酐为酰化剂，对大豆浓缩磷脂进行酰化改性.大豆磷脂中的磷脂酰乙醇胺含有氨基基团，可以与马来酸酐发生酰化反应，即马来酸酐开环与氨基反应生成酰胺键，在磷脂酰乙醇胺上引入了酰胺基团，再用氢氧化钠溶液中和反应生成羧酸基团.由于磷脂分子上接上马来酸酐，分子质量增加，热稳定性、亲水性能改善，HLB 值及对水相的包覆能力增大，乳化稳定性提高.大豆浓缩磷脂的马来酸酐酰化改性，将使其在各行业中的应用得到扩展[6].

1 材料和方法

1.1 药品和试剂

大豆浓缩磷脂：郑州四维磷脂技术有限公司；马来酸酐:天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠、石油醚、95%乙醇、冰乙酸、异辛烷、丙酮、无水乙醚、异丙醇、醋酸、醋酸钠等均为分析纯，正己烷（色谱纯）.

1.2 主要仪器

RE52CS-1 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；PHS-3C 型pH 计:上海仪电科学仪器股份有限公司；LC-10A 高效液相色谱仪、GC-2010 气相色谱仪:日本岛津公司；WQF-510 傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）:北京瑞利分析仪器公司.

1.3 方法

1.3.1 大豆浓缩磷脂酰化改性反应的机理（图1）

大豆浓缩磷脂中的脑磷脂所含氨基与马来酸酐在一定条件下发生氨基反应，生成酰胺键和羧基；并在磷脂的磷酸羟胺基团上引入不饱和双键，使其反应活性增加；磷脂酰化改性后有羧酸官能团生成，酸价偏高，再用氢氧化钠溶液中和生成的羧酸基团，进而增加改性磷脂的亲水性、乳化性和热稳定性等.

图1 大豆浓缩磷脂酰化改性反应机理Fig .1 Reaction mechanism of acylation modification of condensed soybean phospholipids

1.3.2 大豆浓缩磷脂的酰化改性方法

称取一定量大豆浓缩磷脂，于500 mL 的三口烧瓶中，在电热套上真空搅拌加热，加入马来酸酐，反应至规定时间.测定反应产物的酸价、酰化率.根据酰化改性磷脂的酸价滴加质量分数为35%的氢氧化钠溶液，将中和反应产物置于旋转薄膜蒸发器真空脱水，使水分含量在1%以下.

1.3.3 大豆浓缩磷脂的理化指标测定

酸值按照GB/T 5530—2005 的方法测定；水分按照GB/T 5009.3 的方法测定；丙酮不溶物按照SN/T 0802.2 的方法测定；过氧化值按照GB/T 5538 的方法测定；碘值按照GB/T 5532 的方法测定；乙醚不溶物按照SN/T 0802.2 的方法测定.

1.3.4 气相色谱法测定浓缩磷脂的脂肪酸组成

甲酯化方法：按照GB/T 17367—2008 三氟化硼甲酯化法.气相色谱法：按照GB/T 17377—2008动植物油脂脂肪酸甲酯气相色谱分析.

1.3.5 高压液相色谱法测定浓缩磷脂的组成成分按照GB/T 21493—2008 大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的方法测定.

1.3.6 傅立叶变换红外光谱仪测定磷脂结构

涂膜法制样，将样品置于红外光谱仪中进行扫描，扫描的范围为(400～4 000) cm-1，分辨率为4，扫描次数为8 次.

1.3.7 酰化改性大豆浓缩磷脂酰化率的测定

称取1.0 g 磷脂样品，置于100 mL 的烧杯中，加入50 mL 温水，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至磷脂完全溶解，测定溶液的pH.缓慢滴加浓度为0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液至溶液的pH 为8.7，然后加入8.0 mL 浓度为40%的甲醛溶液，溶液的pH会渐渐下降至一定数值.在溶液的pH 稳定后，用浓度为0.01 mol/L 的氢氧化钠溶液滴定，样品溶液的pH 至8.7 为终点，记录试验消耗的氢氧化钠溶液的体积.同时做空白试验.酰化试验的酰化率的计算方法为：

式中：f 为酰化率，%；V 为氢氧化钠溶液的体积，mL.

1.3.8 HLB 值的测定（比拟法）

用Span85 和Tween80 按照不同的比例配制成一系列具有不同HLB 值的混合乳化剂，分别用系列混合乳化剂及待测磷脂样品，与棉籽油按照1∶20(V/V)的比例混合均匀，加入30 mL 蒸馏水经高剪切混合乳化机乳化1 min，边乳化边缓慢加入蒸馏水制成乳化液.倒入50 mL 的具塞量筒中，在65℃恒温烘箱中保存，定时观察记录量筒中乳化液析出油和水的状态，计算出乳化液层比例，对比不同HLB 值的混合乳化剂及待测磷脂的乳化层所占比例，得出待测磷脂样品的HLB 值的范围.

2 结果与讨论

2.1 大豆浓缩磷脂的理化特性指标

按1.3.3 的测定方法分析大豆浓缩磷脂原料的常规理化指标，测定结果如表1 所示.

表1 大豆浓缩磷脂的理化特性指标Table1 The physicochemical property indexes of condensed soybean phospholipids

2.2 大豆浓缩磷脂组成、磷脂脂肪酸组成分析

用高效液相色谱、气相色谱仪对大豆浓缩磷脂组成、磷脂脂肪酸组成和含量进行测定和分析，试验结果如图2、表2 所示.

图2 大豆浓缩磷脂的液相色谱图谱Fig.2 The liquid chromatogram of condensed soybean phospholipids

由图2 可以看出，大豆浓缩磷脂的成分及含量为：磷脂酰乙醇胺（PE），16.56%；磷脂酰胆碱（PC），20.17%；磷脂酸（PA），6.58%；磷脂酰肌醇（PI），11.36%；油脂及其他45.33%.

表2 大豆浓缩磷脂的脂肪酸组成成分分析Table 2 Fatty acid composition of condensed soybean phospholipids

由表2 可以看出，大豆浓缩磷脂的不饱和脂肪酸的含量为79.85%，饱和脂肪酸的含量相对较少，为20.15%.

2.3 大豆浓缩磷脂酰化改性单因素试验

2.3.1 马来酸酐用量对大豆浓缩磷脂酰化改性的影响

在反应温度为55 ℃，反应时间为30 min 的条件下，分别加入3%、4%、5%、6%、7%马来酸酐进行酰化改性.马来酸酐用量对大豆浓缩磷脂酰化改性反应酸价和酰化率的影响如图3 所示.

由图3 可知，随着酰化试剂马来酸酐用量的增加，参与酰化反应的基团增加，反应朝生成酰化物方向进行，酰化程度就越高，酰化率越大，反应生成的羧酸基团就越多，因此酸价就相应增加.当加入量增加到5%时酰化率达到最高；高于5%酰化率有所下降，可能是生成的羧酸基团过多抑制酰化反应的进行，使反应不充分，消耗的顺丁烯二酸酐较少，酰化率有所下降；继续增加顺丁烯二酸酐用量，顺丁烯二酸酐在体系中慢慢水解，使体系中酸价上升.

图3 马来酸酐用量对大豆浓缩磷脂酰化率和酸价的影响Fig.3 Effects of maleic anhydride dosage on the acylation rate and acid value of condensed soybean phospholipids

2.3.2 反应时间对大豆浓缩磷脂酰化改性的影响在马来酸酐用量为5%，温度为55 ℃的条件下，反应时间20、30、40、50、60 min 进行酰化改性反应.时间对马来酸酐酰化改性反应酸价和酰化率的影响见图4.

图4 反应时间对大豆浓缩磷脂酰化率和酸价的影响Fig.4 Effects of reaction time on the acylation rate and acid value of condensed soybean phospholipids

由图4 可知，随着大豆浓缩磷脂酰化反应时间的延长，酰化率逐渐增加，这是因为随着反应时间的延长，酰化试剂和磷脂的接触越来越充分，反应程度升高从而使酰化率升高；反应时间达30 min 时酰化率最高；大于30 min，酰化率渐渐下降，因为反应时间过长抑制酰化反应的进行，从而使酰化率下降.

2.3.3 反应温度对大豆浓缩磷脂酰化改性的影响

在马来酸酐用量为5%，反应时间30 min 的条件下，反应温度为45、50、55、60、65 ℃进行酰化改性，温度对大豆浓缩磷脂酰化改性反应的酰化率和酸价的影响如图5 所示.

由图5 可知，酰化率随着反应温度的增加逐渐升高，这是因为，两种反应物的接触面积增大，使酰化改性反应更充分，酰化率随之升高，当反应温度达到55 ℃时酰化率达到最高；超过温度55℃，酰化率逐渐下降，因为反应温度过高对酰化反应有抑制作用.

图5 反应温度对浓缩大豆磷脂酰化率和酸价的影响Fig.5 Effects of reaction temperature on the acylation rate and acid value of condensed soybean phospholipids

2.3.4 大豆浓缩磷脂酰化改性正交试验分析

根据单因素试验结果，通过正交试验来确定大豆浓缩磷脂酰化改性的最佳工艺条件.马来酸酐对大豆浓缩磷脂酰化改性的因素水平如表3 所示.

表3 大豆浓缩磷脂马来酸酐酰化改性的因素水平Table 3 The factor level of condensed soybean phospholipids maleic anhydride acylation modification

采用L25(56)正交表来安排试验，马来酸酐对大豆浓缩磷脂进行酰化改性正交试验设计和结果如表4 所示.

用Spss 软件对大豆浓缩磷脂酰化改性正交试验的数据进行差异显著性分析，结果如表5 所示.

由表4 可知，大豆浓缩磷脂酰化改性的3 个影响因素的主次顺序为：马来酸酐用量＞温度＞时间.由极差分析可知，正交试验的最佳组合为A3C3B3，即马来酸酐用量为5%，反应温度55 ℃，反应时间是30 min.并对得出的最佳组合进行验证试验，磷脂的酸价从18.45 mg/g 上升至58.85 mg/g，测得反应的酰化率为87.35%.由表5 可知，大豆浓缩磷脂酰化改性反应中，马来酸酐的用量对试验的影响是极其显著的，而反应温度和反应时间对试验的影响都是高度显著的.

表4 大豆浓缩磷脂马来酸酐酰化改性的正交试验设计及结果Table 4 The orthogonal experimental design and results of condensed soybean phospholipids maleic anhydride acylation modification

2.3.5 磷脂的红外图谱分析

在傅立叶变换红外光谱仪上分别对浓缩磷脂和未中和酰化改性磷脂进行红外光谱扫描，结果如图6 所示.

由图6 可知，相对于大豆浓缩磷脂原料，酰化改性磷脂的红外吸收光谱中，一个新的吸收峰出现在波数为（1 500～1 700）cm-1之间，也就是酰化改性磷脂之中有新的基团，即酰胺基团的引入.

2.4 酰化改性磷脂的碱中和及理化性能

酰化改性磷脂有羧酸官能团和酸酐存在，酸价过高，功能特性会受到一定程度的影响，需碱中和降低酸价.用35%的氢氧化钠溶液中和，然后进行旋蒸薄膜真空脱水，制得碱中和酰化改性磷脂产物，大豆浓缩磷脂、酰化改性磷脂的理化特性指标如表6 所示.

表5 大豆浓缩磷脂马来酸酐酰化改性试验因素间影响分析Table 5 Analysis of the effect of experimental factors on condensed soybean phospholipids maleic anhydride acylation modification

图6 大豆浓缩磷脂和未中和酰化改性磷脂的红外光谱图Fig.6 The infrared spectra of condensed soybean phospholipids and unneutralized acylated phosphatide

表6 大豆浓缩磷脂、酰化改性磷脂的理化特性Table 6 The physicochemical properties of condensed soybean phospholipids and acylated phosphatide

由表6 可知，马来酸酐对大豆浓缩磷脂酰化改性制得的未中和酰化改性磷脂和酰化改性磷脂的乙醚不溶物含量、丙酮不溶物含量和碘值的变化均不太明显；未中和酰化改性磷脂的酸价达58.85 mg/g，碱中和之后酰化改性磷脂的酸价下降至18.29 mg/g.

2.5 比拟法测定磷脂HLB 值结果

按照1.3.8 中的方法，测定大豆浓缩磷脂、酰化改性磷脂及未中和酰化改性磷脂的乳化层比例，与Span85 和Tween80 按照不同的比例配制成标准HLB 值（3～8）的乳化液进行对比，估算出各磷脂的HLB 值所处的大致范围，结果如表7 所示.

由表7 可知，各磷脂的HLB 值范围大致为：大豆浓缩磷脂3～4、酰化改性磷脂5～7，其中未中和酰化改性磷脂制成的乳化液在很短时间内油水就完全分离，其HLB 值为2～3；以上结果说明酰化改性磷脂的HLB 值较高，亲水性能较好.

3 结论

马来酸酐与大豆浓缩磷脂酰化改性反应影响因素的主次顺序为：马来酸酐用量＞反应温度＞反应时间.最佳工艺条件是：马来酸酐的加入量为5%，反应温度为55 ℃，反应时间为30 min.此条件下，磷脂的酸价从18.45 mg/g 上升至58.85 mg/g，酰化改性反应的酰化率为87.35%.经碱中和酰化改性磷脂酸价下降至18.29 mg/g.