胃黏膜损伤大鼠胃组织 P2X1、P2X3和P2X5的表达及电针对其影响

朱小香 郑淑霞 萨喆燕 修春英 董亚琴 许金森

既往研究表明［1-3］，针刺足三里穴对胃黏膜损伤具有防治作用，然而其具体作用机制仍不清楚。上世纪70年代以来发现传统的能量分子ATP也是一种神经递质，其参与了从中枢到外周诸多组织细胞的生理生化机能。现代生物学对ATP及其受体P2X的研究成果为揭示针刺信号的转换机制提供了充实的理论依据。目前研究发现P2X有P2X1-77个亚型，其中P2X1被认为与膀胱机能调节密切相关［4］。越来越多的研究证明P2X受体在胃肠道平滑肌的收缩和舒张中发挥着重要作用［5］，但具体亚型在其中所扮演的角色尚未完全清楚。胃和膀胱的共同特点之一是平滑肌都是其运动单元的一个重要组成部分，那么P2X1等亚型是否也在胃功能调节中起重要作用?另外，电针足三里穴治疗胃黏膜损伤的作用机制是否与P2X受体亚型相关?为此，本文运用分子生物学方法从基因转录水平研究正常大鼠和胃黏膜应激损伤大鼠胃组织 P2X1、P2X3、P2X5亚型的表达情况以及电针足三里穴对其的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

成年SD雄性健康大鼠24只(福建医科大学实验动物中心提供，清洁级，许可证号:SCXK(闽)2012-0001。体重(250±25)g。动物称重编号，随机分为3组:正常对照组(正常组)、胃黏膜应激损伤模型组(模型组)、电针足三里穴组(电针组)各8只。

1.2 胃黏膜应激损伤模型制备

胃黏膜应激损伤大鼠模型制备采用冷-束缚应激法［6］并加以改良。造模方法:大鼠禁食不禁水24小时，束缚四肢于自制铁板上，放入7℃冰箱，冷应激2.5小时后取出松绑。模型成功的标准:大鼠安静，萎靡不振，身体蜷缩;形态学上动物胃黏膜有出血点和溃疡灶。除正常组外，其余两组大鼠均按冷-束缚应激法复制胃黏膜应激损伤模型。

1.3 干预方法

模型复制后，次日电针组给予电针治疗:一次性无菌针灸针(0.18×13mm)直刺足三里穴1 cm(参考《实验针灸学》大鼠针灸穴位图谱定位［7］)，参考电极置于胃经线上足三里穴下0.5 cm处，疏密波，10/20Hz，刺激强度2～3 V，以下肢出现轻微抖动为度，电针20分钟，连续三天。模型组和正常组均不进行电针干预。

1.4 主要试剂

总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均为Promega生物公司产品;聚合酶链反应(PCR)试剂盒为TIANGEN公司产品;引物由Invitrogen生物公司合成;GeneFinder染料为致善生物公司产品;DNA Marker为Bio Flux公司产品。

1.5 主要仪器

DU530核酸/蛋白分析仪(Beckman Coulter公司);Veriti PCR仪(ABI公司);Gene Genious生物成像系统(SYNGENE公司);WQ-IOD1电针仪(北京欣东华电子仪器有限公司)。

1.6 P2X亚型mRNA检测

电针组治疗结束后24小时以1%乌拉坦麻醉各组大鼠，剖腹取胃，沿胃大弯剪开、展平并用冰生理盐水清洗胃内容物，全胃剪碎后置于预装有100 μL总RNA提取裂解液的EP管中，液氮研磨后按Promega公司Z3100总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。然后核酸蛋白分析仪检测RNA纯度及浓度;取1μg总RNA，使用Promega公司A3500反转录试剂盒进行逆转录反应;取3μL逆转录产物进行P2X亚型的PCR反应，同时设置β-actin作内参照。大鼠P2X1上游引物5'-AAAGCAGAAAGGAAAGCCCA-3'，下游引物为 5’-ATACAGTCCGTGGAACTGG-3’，扩增片段长度为435 bp;P2X3上游引物5'-CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3'，下 游 引 物 为 5'-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3'，扩增片段长度为520 bp;P2X5上游引物5'-AGTCATCAACATTGGTTCTG-3'，下 游 引 物 为 5'-CAGGAGACCTTCCGTGAAA-3'，扩增片段长度为542 bp;β-actin上游引物为 5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，下游引物为 5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，扩增片段长度为240bp。PCR反应条件为:94℃预变性3分钟→(94℃变性40秒，退火1分钟，72℃延伸1分钟)，共循环35次→72℃延伸10分钟;退为温度如下:P2X1为53℃，P2X3和P2X5前6个循环为53℃，后29个循环为48.5℃。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，使用生物成像系统对电泳条带进行图像采集和光密度值分析，目的基因与内参β-actin电泳条带的光密度比值即为目的基因mRNA在组织中的相对表达量。

1.7 统计学处理

2 结果

各组大鼠胃组织均表达P2X1、P2X3、P2X5mRNA。经单因素方差分析LSD检验，模型组与正常组相比，大鼠胃组织P2X1mRNA表达显著下降(P＜0.01);而电针组与模型组相比，大鼠胃组织P2X1mRNA表达显著升高(P＜0.05)。P2X3、P2X5mRNA组间未见显著差异。对正常组大鼠胃组织P2X1、P2X3、P2X5受体亚型作相关性分析，发现正常组大鼠胃组织P2X3和P2X5呈显著正相关(P＜0.05，r(3，5)=0.755)。见表 1。

表1 各组大鼠胃组织P2X亚型mRNA的比较(，n=8)

表1 各组大鼠胃组织P2X亚型mRNA的比较(，n=8)

注:与正常组比较，a P＜0.01;与模型组比较，b P＜0.05。正常组3个亚型作相关性分析，P2X3与 P2X5显著正相关，c P＜0.05，r(3，5)=0.755

-actin正常组 0.1789±0.0342 0.2473±0.0609c组别 P2X1/β-actin P2X3/β-actin P2X5/β 0.4485±0.0743 0.7851±0.0739 0.6653±0.0669模型组 0.0543±0.0274a 0.3293±0.1298 0.6853±0.1102电针组 0.1498±0.0162b

3 讨论

P2X受体是ATP门控的离子通道，当它与胞外ATP结合时，P2X通道打开，允许Ca2+、单价阳离子以及小的有机离子通过［8］，继而引起一系列生理或病理变化。P2X受体广泛表达于从变形虫到人类的一系列生物体中［9］。目前已克隆出7个P2X亚型，分别为 P2X1，P2X2，…P2X7［10］。这些亚单位能够以同聚体或异聚体的形式形成功能性通道［11-12］。许多细胞同时表达不同类型的P2X亚单位，也暗示天然的P2X受体通常以异聚体的形式存在。本研究团队对正常组3个亚型间的相关性进行分析发现，P2X3与P2X5呈显著正相关(P＜0.05)，提示在大鼠胃组织中P2X3和P2X5二者之间可能在mRNA转录水平存在共表达，它们可能以同聚体的方式存在，也可能以异聚体的形式存在。

P2X1亚型在调节膀胱功能方面具有重要作用［4］。OREILLY 等［13］于2001 年用定量 RT-PCR 比较胎儿和成年人的膀胱表达7个已知P2X受体的情况，发现正常成人膀胱P2X1在信使RNA水平是主要嘌呤受体。之后，李永刚等［4］研究发现P2X1受体在膀胱出口部分梗阻大鼠膀胱组织中表达升高，推测其可能参与慢性膀胱出口梗阻后膀胱的生理或病理功能的调节。杨昕等［14］认为P2X1受体可能在介导嘌呤能神经对逼尿肌功能的调节中发挥重要作用。越来越多的研究证明P2X受体在胃肠道平滑肌的收缩和舒张中也发挥着重要作用［5］。本研究发现胃黏膜应激损伤模型组与正常组相比，大鼠胃组织P2X1mRNA表达显著下降(P＜0.01)，提示P2X1亚型在胃功能的生理和病理调节中具有重要作用。胃和膀胱的共同特点之一是平滑肌都是其运动单元的一个重要组成部分，结合前人研究结果，笔者推测P2X1可能在平滑肌功能调节中具有重要的作用。

随着人们对ATP及其受体P2X功能特点认识的不断深入，有学者推测它们在针刺信号转换机制中可能具有重要的作用［15］。针刺作为一种机械性刺激为主的复杂刺激源，只有转化为生物信号才能被机体所识别。ATP所具备的信号分子特征，以及P2X受体的组织分布特点，强烈暗示ATP-P2X在针刺信号转换中具有重要作用［15］。因此，本研究团队以临床上疗效较为明确的“针刺足三里调节胃功能”为研究主题，以 P2X1、P2X3、P2X5作为观察指标，在针刺信号转换机制研究方面作一尝试。本研究发现电针组大鼠胃组织P2X1mRNA显著高于模型组(P＜0.05)，提示电针足三里穴对胃黏膜应激损伤的调节机制之一可能与P2X1mRNA表达上调相关。P2X受体是ATP门控的离子通道，其功能的发挥需要ATP的激活。有研究发现高浓度的ATP能在短时期内刺激P2X1受体高表达［16］。电针足三里刺激穴位可能通过经穴与脏腑的特异联系以及神经-内分泌等途径使支配胃平滑肌的副交感神经末梢释放ATP增加以及胃组织表达P2X1等升高，在这些因素的协同作用下通过改善胃黏膜血流供应、胃组织能量供应等途径促进胃溃疡的愈合。此外，P2X1受体是血小板三种P2受体中的一种，其被ATP激活后可介导血小板聚集，有利于正常止血［17］，在溃疡病灶的发生发展中，这将有利于防止溃疡灶的进一步出血。当然，这只是根据研究结果所做的推测，具体机制还需进一步的实验研究。今后也有必要对针刺局部组织和胃组织中的ATP和其他P2X受体亚型进行检测，以更明确各个P2X受体亚型在针刺效应中的作用。

［1］ 黎喜平，严洁.针灸对胃粘膜损伤保护作用机制的研究进展［J］.针刺研究，2005，30(1):60-63.

［2］ 刘涌.电针足三里对应激性胃粘膜损伤的保护作用［J］.安徽中医学院学报，2000，19(2):27-30.

［3］ 朱舜丽，许冠荪，陈金珠，等.电针足三里穴对应激性胃溃疡大鼠一氧化氮和儿茶酚胺的影响［J］.中国中西医结合脾胃杂志，1996，4(1):39.

［4］ 李永刚，钟甘平，岳中谨，等.部分膀胱出口梗阻后 P2X1嘌呤受体在膀胱的表达［J］.第四军医大学学报，2005，26(10):878-880.

［5］ 高显奎，余跃.P2嘌呤受体与胃肠运动的研究进展［J］.临床消化病杂志，2009，21(5):315-317.

［6］ 黄碧兰，余良主，刘寿仙.大鼠孤束核微量注射γ-氨基丁酸对电针抗应激性胃黏膜损伤的影响［J］.中国中西医结合消化杂志，2011(6):381-384.

［7］ 李忠仁.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2007:255.

［8］ Valera S，Hussy N，Evans R J，et al.A new class of ligand-gated ion channel defined by P2x receptor for extracellular ATP［J］.Nature，1994(6497):516-519.

［9］ Fountain SJ，Parkinson K，Young M T，et al.An intracellular P2X receptor required for osmoregulation in Dictyostelium discoideum［J］.Nature，2007，448(7150):200-203.

［10］ Burnstock G，King B F.Numbering of cloned P2 purinoceptors［J］.Drug development research，1996，38(1):67-71.

［11］ Nicke A，Bäumert H G，Rettinger J，et al.P2X1 and P2X3 receptors form stable trimers:a novel structural motif of ligand‐gated ion channels［J］.The EMBO Journal，1998，17(11):3016-3028.

［12］ Stoop R，Thomas S，Rassendren F，et al.Contribution of individual subunits to the multimeric P2X2 receptor:estimates based on methanethiosulfonate block at T336C［J］.Molecular pharmacology，1999，56(5):973-981.

［13］ BA O，AH K，TK C，et al.A quantitative analysis of purinoceptor expression in human fetal and adult bladders［J］.The JOURNAL OF UROLOGY，2001，165(5):1730-1734.

［14］ 杨昕，宋波，方强，等.P2x受体亚型在大鼠逼尿肌不稳定中的作用研究［J］.第三军医大学学报，2004，26(8):710-713.

［15］ 聂坤.P2X受体，ATP和针刺的信号转换［J］.上海针灸杂志，2009，28(5):298-300.

［16］ 陈鸣.大鼠脑创伤后嘌呤受体 P2X1亚型表达的研究［D］.上海:第二军医大学，2005.

［17］ 李家增，侯明，包承鑫.血小板疾病［M］.北京:科学技术文献出版社，2009:237-238.