基于“二维特征鉴别法”的巴西草药GENGIBRE真伪鉴别

徐文英 马恺悦 冯孟鑫 顾选 李妍芃 赵百孝 刘春生 马长华 韩丽

干姜为姜科植物Zingiber offcinale Rosc．的干燥根茎［1］，收载于2010年版《中华人民共和国药典》(一部)，在中国及巴西均是药食两用的常用药材，具有温中散寒，回阳通脉，温肺化饮等功效，可用于脘腹冷痛，呕吐泄泻，肢冷脉微，寒饮喘咳。根据《葡汉词典》［2］，巴西草药GENGIBRE在葡萄牙语中意为姜，在国外作为调味品及辛香料被广泛使用，与中国干姜的食用价值非常类似。为扩大中国干姜的药用资源，本文拟从基因鉴别与化学成分鉴别相结合的角度对巴西草药GENGIBRE进行真伪鉴别及品种鉴定。

DNA条形码技术是目前中药真伪鉴别及准确物种鉴定可靠的技术和方法，本研究拟对以巴西草药GENGIBRE的ITS序列进行DNA测序，作为基因鉴别结果。此外，中药干姜中所含 6-姜辣素(6-Gingerol)为其辛辣物质，具有强心、降血压、降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎止痛等广泛的药理作用，其含量直接影响干姜的品质和药效。因此，选用6-姜辣素为指标对两者进行化学成分鉴别。通过巴西草药GENGIBRE与中国干姜中6-姜辣素的含量差异，结合两者的DNA条形码匹配度结果，为巴西草药GENGIBRE的品质鉴定及扩大中国干姜的药用资源提供理论依据［3-11］。

1 材料与仪器

1．1 材料

药材:巴西草药GENGIBRE 3份(巴西隆城市场，样品的凭证标本保存于北京中医药大学标本室)、中国干姜(北京市花家地南里同仁堂药店，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc．的干燥根茎)、6-姜辣素(中国药品生物制品鉴定所，批号:111833-201102);试剂:乙腈(色谱纯，Fisher)、甲醇(色谱纯，Fisher)、娃哈哈纯净水、液氮。

1．2 仪器

植物DNA提取试剂盒(北京博迈德生物有限公司，批号:69691125)、TProfessiona型PCR扩增仪(德国 Biometra公司，批号:20092237)、ContigExpress软件。

岛津LC-20AT液相色谱仪(日本岛津公司)、水浴锅、粉碎机(型号:FW-100，北京中兴伟业仪器有限公司)、电子天平sartorius AG BS110S(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、XBrige C18色谱柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm，美国 Waters公司)、FW400A高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)、Sartorius BS110S分析天平、KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

采用DNA条形码技术和HPLC技术对巴西草药GENGIBRE进行真伪鉴别分析。即先根据样品的遗传信息确定其基源，结合指标性成分的含量高低或存在与否，相互印证得出结论。

2．1 DNA条形码分析

2．1．1 DNA提取 样品经乙醇消毒后，取每份样品加液氮研磨成细粉，用博迈德DNA提取试剂盒提取，按照说明书提取总DNA，取5μL 1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

2．1．2 ITS序列的扩增 采用扩增ITS序列的通用引物，ITS上游引物 P1:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3';ITS下游引物P4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。扩增反应在PCR扩增仪上进行，50μL反应体系中含模板2．5μL，Tap Mix酶25μL，引物 P1 2．5 μL，引物 P4 2．5 μL。扩增程序为:94℃预变性5分钟;94℃变性50秒;55℃退火50秒;72℃延伸1分钟;35个循环，最后72℃延伸10分钟。

2．1．3 测序 PCR产物在紫外灯下从1%的琼脂糖凝胶上进行切胶，由上海生工生物工程有限公司测序部测序。各样品均采用正向和反向测序，以保证测序的准确性。PCR产物电泳结果如图1所示，PCR产物电泳在750 bp左右出现单一、清晰且明亮的条带。3份样品的测序峰图良好，测序结果一致，截取ITS片段后选择一条序列用于后续分析。

图1 PCR产物电泳结果

2．1．4 序列分析 利用contig1软件对测序获得的正、反向序列进行拼接，根据BLAST所获相似度最高物种的ITS序列边界，截取待鉴定物种的ITS序列，对截取后待鉴定样品的ITS序列进行检索，综合考虑Score值、Coverage值、evalue值，初步确定相似度最高的物种为待鉴定样品的基原。结果如图2所示。图2表明，样品与芸香科吴茱萸植物相似度最高，相似度范围为97% ～99%，因此初步鉴定该样品来自芸香科吴茱萸Tetradium ruticarpum。

2．2 HPLC 法分析

2．2．1 对照品及供试品溶液的制备 对照品溶液制备:取 6-姜辣素对照品，精密称定，配制成0.1014 mg/mL的对照品溶液，使用前0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

图2 巴西样品GENGIBRE的ITS序列BLAST结果

表1 中国干姜6-姜辣素的加样回收率结果

图3 对照品溶液及各供试品溶液的HPLC图谱

供试品溶液制备:取各样品粉末0．8 g(粉碎机粉碎，过80目筛)，置50 mL锥形瓶中，准确移取甲醇25 mL加入，准确称量，水浴加热回流30分钟，放冷至常温，甲醇补重，摇匀，过滤，续滤液0．45μm微孔滤膜过滤，即得。

2．2．2 色谱条件 色谱柱:XBrige C18色谱柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm，美国 Waters公司)，流动相:0 ～20 分钟:乙腈 －水(45:55)，流速:1．0 mL/分钟，进样量:10μL，柱温:30℃，检测波长:280 nm。

2．2．3 专属性考察 按”2．2．1”项下方法制备对照品溶液及各供试品溶液，分别精密吸取对照品及各样品供试溶液10μL，按上述色谱条件进样分析，各色谱图见图3。如图所示，测定方法专属性好，待测成分与其他成分分离度大于1．5，且其他成分对待测成分测定无干扰。

2．2．4 线性关系考察 精密吸取”2．2．1”项下对照品溶液 1 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按”2．2．2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。线性方程为 Y=737357X －34852，R2为0．9999，结果表明6-姜辣素在0．1014～4．056μg质量范围内线性关系良好。

2．2．5 精密度考察 精密称定中国干姜样品0.8 g，按“2．2．1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，每次进样10μL，记录峰面积。结果显示，RSD为0．45%，表明本法精密度良好。

2．2．6 稳定性考察 精密称定中国干姜样品0．8 g，按“2．2．1”项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0小时、2小时、4小时、6小时、8小时，按”2．2．2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果显示，RSD为1．07%，表明本法稳定性良好。

2．2．7 重现性考察 精密称定中国干姜样品0．8 g，一式 6 份，按“2．2．1”项下方法制备供试品溶液，按“2．2．2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算RSD值。结果显示，RSD为1．05%，表明本法重复性良好。

2．2．8 加样回收率实验 取6份中国干姜样品，每份约0．4 g，精密称定，分别精密加入一定量的6-姜辣素标准溶液，按“2．2．1”项下方法制备供试品溶液，按“2．2．2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算回收率与RSD，6-姜辣素的平均回收率为103．5%，RSD为2．34%，表明本法含量测定结果良好。结果见表1。

2．3 6-姜辣素的含量测定结果

分别取巴西草药GENGIBRE、中国干姜约0．8g，精密称定，一式3份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，并按”2．2．2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算待测成分含量，巴西草药、中国干姜中6-姜辣素含量分别为0．112%和0．759%。结果见表2。

表2 巴西草药GENGIBRE、中国干姜中6-姜辣素的含量(n=3)

3 讨论

本实验采用“二维特征鉴别法”，对未知巴西草药GENGIBRE进行以中国干姜为标准的定向真伪鉴别。其一借助中药DNA条形码技术，对样本进行基原判别;其二利用HPLC技术对样品与定向鉴别品种中指标性成分进行含量测定。最终将所得判别结果与含量测定结果进行相互比对，综合评判样品真伪。由DNA条形码技术结果可知巴西草药GENGIBRE与芸香科植物吴茱萸相似度最高，相似度范围在97%～99%，因此初步鉴定该样品来自芸香科吴茱萸Tetradium ruticarpum。由HPLC法测定干姜中活性成分6-姜辣素含量结果可知，两者均含有6-姜辣素，含量分别为0．112%和0．761%。巴西样品GENGIBRE中6-姜辣素含量远远低于2010年版《中华人民共和国药典》(一部)规定标准0．60%，而中国干姜样品品质良好。综合两者结果可知，仅从化学成分角度进行真伪鉴别易出现假阳性，而仅从基因角度鉴别无法得知样品品质。因此，本实验利用两种方法结合比较，从而对未知样品进行“真伪优劣”的全面鉴别。

另外，本实验对巴西药草GENGIBRE中6-姜辣素含量测定时出现假阳性结果，可能是由于吴茱萸的炮制方法中包含姜制法。因此，在进行干姜的真伪鉴别时，若干姜样品粉末中掺杂姜制吴茱萸粉末，则仅依据HPLC图谱中6-姜辣素峰的有无无法判定未知样品是否为干姜，还需要额外的判别指标进行印证。本文采用的“二维特征鉴别法”为中药的质量控制、资源普查、新品种选育等方面的研究提供了新的思路，具有非常重要的现实意义。

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