基于“二维特征鉴别法”的巴西草药TANCHAGEM真伪鉴别

徐文英 马恺悦 冯孟鑫 顾选 李妍芃 赵百孝 刘春生 马长华 韩丽

车前草为车前科Plantaginaceae植物车前Plantago asiatica L．或平车前Plantago depressa wild．的干燥全草，是2010年版《中华人民共和国》(一部)收载的常用中药。车前草性寒，味甘，具有清热利尿、祛痰、凉血、解毒之功效，用于水肿尿少、暑湿泻痢、痰热咳嗽、痈肿疮毒等症［1］。TANCHAGEM为巴西的常用草药，根据《葡汉词典》［2］，TANCHAGEM 在葡萄牙语中意为车前草，其药物性状与功能主治也与中药车前草类似，但由于巴西各地区间发展不平衡，其民族药的研究开发往往存在缺少文献记载、品种混乱、基原不清、品质不详等现象［3］。因此，为解决上述质量控制中存在的问题，本课题组对巴西草药TANCHAGEM进行全面的质量研究，提出了一种新型研究思路“二维特征鉴别法”，即从药物本身的化学特征和遗传学特征两方面入手，先采用DNA条形码技术对药物的基原进行确定，解决“真伪问题”;再通过HPLC技术对药物的化学信息进行检测，解决“优劣问题”。

首先采用DNA条形码技术并利用ContigExpress软件，检索NCBI中注册的与巴西草药相似度最高的物种，以相似度97%以上为物种溯源依据，确定其基原。其次以车前草的专属性成分大车前苷为其指标成分，利用HPLC法比较巴西草药TANCHAGEM与中药车前草中大车前苷的含量，综合两者结果为巴西草药TANCHAGEM及相关制剂的质量标准制订提供科学依据［4-10］。

1 材料与仪器

1．1 材料

药材:巴西草药TANCHAGEM三份(巴西隆城市场)，样品的凭证标本保存于北京中医药大学大学标本室;中药车前草(北京市花家地南里同仁堂药店，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为车前科植物车前Plantago asiatica L．的干燥全草)，大车前苷(中国药品生物制品鉴定所，批号:111833-201102)。试剂:乙腈(色谱纯，Fisher)，甲醇(色谱纯，Fisher)，娃哈哈纯净水，液氮。

1．2 仪器

植物DNA提取试剂盒(北京博迈德生物有限公司，批号:69691125)、TProfessiona型PCR扩增仪(德国 Biometra公司，批号:20092237)、ContigExpress软件、FW400A高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)、Sartorius BS110S分析天平、KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、Waters 1525高效液相色谱仪(美国Waters公司)、Breeze 2 HPLC色谱工作站，Waters 2998二极管阵列检测器、Waters 2707自动进样器、Waters 038040柱温箱、资生堂 C18色谱柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)。

2 方法与结果

采用DNA条形码技术及HPLC技术对巴西草药TANCHAGEM以及中药车前草进行检测分析。

2．1 DNA 条形码分析

2．1．1 DNA提取和PCR扩增 取巴西样品，一式三份，分别用液氮冷冻后研磨成细粉，采用植物DNA提取试剂盒提取总DNA。采用ITS序列通用引物，上游 P1:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3';下游 P4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，在 PCR扩增仪上进行扩增。PCR扩增条件:50μL体系含2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物 P1和 P4各加2．5 μL(5 μmol/L)，DNA 模板 4 μL，ddH2O16 μL。PCR扩增程序:94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环后，72℃延伸10分钟。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下检视，产物均由上海生工生物工程有限公司测序部测序。各样品均采用正向和反向测序，以保证测序的准确性。

图1 TANCHAGEM的性状图

2．1．2 序列分析方法 利用ContigExpress软件对测序获得的正、反向序列进行拼接，根据NCBI中BLAST功能，检索NCBI中注册的相似度最高的物种，按照相似度最高的物种截取ITS全长。以相似度90%以上为属的溯源依据，以相似度97%以上为物种溯源依据，获得溯源结果。

2．2 特征图谱分析

2．2．1 对照品及供试品溶液的制备 对照品溶液的制备 取大车前苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0．1 mg的溶液，即得。取样品粉末(60目)1 g，一式三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2．2．2 色谱条件 色谱柱:资生堂C18色谱柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈 －0．1%甲酸溶液(17:83);检测波长:330 nm;流速:1．0 mL/min;进样量:10μL;柱温:30℃。

2．2．3 专属性考察 按“2．2．1”项下方法制备对照品溶液及各供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液或供试品溶液10μL，按上述色谱条件进样分析，各色谱图见图2。如图所示，测定方法专属性好，待测成分与其它成分分离度大于1．5，且其他成分对待测成分测定无干扰。

图2 对照品溶液及各供试品溶液的HPLC图

2．2．4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按“2．2．2”项下色谱条件进行测定，记录峰面。以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程:Y=1445396276687．18X － 182497．06，R2=0.9989。结果表明，大车前苷在0．1014～4．056 μg质量范围内线性关系良好。

2．2．5 精密度考察 取大车前苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，按“2．2．2”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，每次进样10μL，记录峰面积。RSD为1．10%，符合2010年版《中华人民共和国》(一部)规定，本法精密度良好。

2．2．6 稳定性考察 取中国车前草样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12 小时，在上述色谱条件下进样分析，记录峰面积。RSD为2．00%，符合2010年版《中华人民共和国》(一部)规定，本法稳定性良好。2．2．7 重复性考察 取中国车前草样品，一式6份，按“2．2．1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，记录峰面积，计算 RSD值。RSD为1．60%，符合2010年版《中华人民共和国》(一部)规定，表明本法重复性良好。

2．2．8 加样回收率实验 取6份中国车前草样品，每份约0．5 g，精密称定，分别精密加入一定量的大车前苷标准溶液，按“2．2．1”项下方法制备供试品溶液，按“2．2．2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算回收率与RSD。结果表明大车前苷的平均回收率为105．8%，RSD为2．00%，均符合2010年版《中华人民共和国》(一部)规定，表明本法含量测定结果良好。见表1。

2．3 结果

2．3．1 DNA条形码结果 3份巴西样品测序结果一致，选择一条序列用于后续分析。截取ITS片段后，经BLAST检索，样品与车前科车前属植物相似度最高，相似度范围为96～99%，因此巴西草药TANCHAGEM来自车前科车前属Plantago L．植物。根据DNA条形码相似度达到99%以上的溯源指标，Plantago myosuros、Plantago australis、Plantago virginica、Plantago uniglumis、Plantago trinitatis、Plantago asiatica可能为巴西草药TANCHAGEM的基原。见图3～4。2．3．2 大车前苷含量测定结果 分别取巴西草药TANCHAGEM、中药车前草约1 g，精密称定，一式三份，按“2．2．1”项下方法制备供试品溶液，按“2．2．2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算待测成分含量，结果见表2。

表1 中国车前草中大车前苷的加样回收率结果

图3 巴西样品TANCHAGEM的ITS片段图

图4 巴西样品TANCHAGEM的ITS序列BLAST结果

表2 巴西草药TANCHAGEM、中国车前草中大车前苷的含量(n=3)

巴西样品TANCHAGEM与中药车前草的特征性谱图相似度极高，且两者均含有2010年版《中华人民共和国》(一部)规定的车前草指标成分大车前苷，巴西车前草中大车前苷含量为0．1025%，中药车前草中含量为0．1030%，两者含量接近，均符合2010年版《中华人民共和国》(一部)规定。巴西草药TANCHAGEM内控指标符合要求，品质优良。

3 讨论

本实验采用“二维特征鉴别法”，利用中药DNA条形码的遗传学唯一特性，以及中药指标性成分可量化的特点，对未知样品按照先“真伪”再“优劣”的研究思路进行质量控制，该法可实现对样品基原、指标性成分以及相应HPLC图谱的综合控制，相较于仅考察单一指标的传统质控方法，“二维特征鉴别法”能更为全面的反应样品信息。

综上所述，巴西样品TANCHAGEM为车前科车前属Plantago L．植物，其HPLC图谱与中药车前草相似度极高，且所含大车前苷含量符合2010年版《中华人民共和国》(一部)规定。本实验为下一步是否扩大样本量进行采摘和研究巴西车前草提供了参考依据，同时也为巴西车前草的质量研究、药用价值研究、是否引种巴西车前草以及扩大中药资源和应用等方面提供了重要依据。

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国(一部)［M］．北京:中国医药科技出版社，2010:14．

［2］ 陈用仪．葡汉词典［M］．北京:商务印书馆，2010．

［3］ 许利嘉，肖伟，马培，等．具开发前景的南美洲常用草药简介［J］．现代药物与临床，2011，26(2):84-90．

［4］ 李敏，程敏．中药车前草化学成分与药理研究的新进展［J］．现代中医药，2005，(3):60．

［5］ 耿放，孙虔，杨莉，等．车前子与车前草利尿作用研究［J］．上海中医药杂志，2009，43(8):72．

［6］ Choi SY，Jung S H，Lee H S．Glycation in hibitory activity and the identification of an active compound in Plantago asoatica extract［J］．Phytother Res，2008，(22):323．

［7］ Chiang L C，Chiang W，Chang M Y，et al．Antiviral activity of Plantago major extracts and related compounds in vitro［J］．Antiviral Res，2002，55(1):53-62．

［8］ Chung M J，Park K W，Kim K H．Asian plantain(Plantago asiatica)essential oils suppress 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-co-enzyme A reductase expression in vitro and in vivo and show hypocholesterolaemic properties in mice［J］．Br J Nutr，2008，99(1):67-75．

［9］ Nhiem N X，Tai B H，Van Kiem P，et al．Inhibitory activity of Plantago major L．on angiotensin I-converting enzyme［J］．Arch Pharm Res，2011，34(3):419-423．

［10］ 俞亚静，方晶．车前草水提取物对肝脏保护作用的实验研究［J］．中国实用医药，2008，3(16):71-72．