APP下载

HPLC-DAD法测定洋葱中黄酮类含量*

2015-03-25丁玉莲王亚楠付英杰王建安

济宁医学院学报 2015年3期
关键词:项下芦丁黄酮类

任 强 丁玉莲 王亚楠 陈 迪 付英杰 王建安

(济宁医学院药学院,山东 日照276826)

洋葱(Allium Cepa Linn)为百合科(Liliaceae)葱属,两年生草本植物,又称葱头、圆葱。药理研究表明洋葱具有消炎抑菌、抗癌、抗血小板凝聚、降血糖、降血脂和胆固醇、抗氧化等多种药理作用[1-5]。目前,对洋葱中黄酮类化学成分定量分析的研究较少[6-9]。

黄酮类化合物是植物中分布非常广泛的一类天然产物,具有特征紫外吸收光谱,在250~265nm和345~355nm有最大紫外吸收[10]。洋葱是黄酮类化合物含量较高的蔬菜之一,其中黄酮类化合物主要是黄酮醇及其苷类,主要包括槲皮素、山奈酚、槲皮素-4′-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、杨梅 黄 酮、桑 色 素 等[7,9]。 本 文 拟 采 用 HPLCDAD方法,以芦丁为对照品,对其中主要的黄酮类化学成分进行定量分析,为进一步合理食用以及洋葱加工品的质量控制提供参考。

1 仪器与实验材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪为Shimadzu LC-20AT,配有双泵;SIL-20A 自 动 进 样 器;CTI-20AC 柱 温 箱;SPD-M20A检测器;LC solution数据处理工作站;Shimadzu VP-ODS(250mm ×4.6mm,5μm)色谱柱;电子天平(准确至千分之一,北京赛多利斯科学仪器有限公司);KQ-500DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);溶剂过滤器(天津津腾公司);循环水真空泵(郑州科创仪器有限公司)。

1.2 实验材料

芦丁(批号:MUST-13040302)北京恒元启天化工技术研究院&北京世纪奥科生物技术有限公司;乙腈,色谱级,购于Burdick &Jackson公司;水,去离子水,购于杭州娃哈哈公司;圆葱购买日照大润发超市。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品各约10.05mg,置于10 ml容量瓶中,加80%乙醇溶液使溶解并稀释定容至刻度,摇匀,得到约1.005mg/ml的对照品储备液。用80%乙醇溶液按一定比例稀释,得到系列浓度的对照品标准曲线溶液(5.0μg/ml、10.0μg/ml、50.2μg/ml、100.5μg/ml、251.2μg/ml、502.5 μg/ml)。

2.2 供试品溶液的制备

取洋葱1.0g,精密称定,置具塞圆底玻璃试管中,精密加入80%乙醇5ml,密塞,称定重量。室温浸泡15min后,超声提取(功率100W,频率40 kHz)30min,放冷,再称定重量,用80%乙醇补足减失的重量,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,得供试品溶液。

2.3 色谱条件及系统适用性试验

Shimadzu VP-ODS (250mm × 4.6mm,5 μm)色谱柱;流动相A为水,流动相B为乙腈,梯度洗脱程序为0~20min 5%~95%B,20~21min 95%~5%B,21~25min 5%B;流速1ml/min;柱温30°C;检测波长为350nm;进样量20μL,上述色谱条件下,分析对照品和样品。对照品芦丁和洋葱样品色谱图分别见图1和2。

图1 对照品芦丁的色谱图

图2 样品的色谱图及4个主要黄酮类化合物的紫外光谱图

2.4 含量测定方法学验证

2.4.1 线性关系考察 将系列浓度的标准曲线样品 溶 液 (5.0μg/ml、10.0μg/ml、50.2μg/ml、100.5μg/ml、251.2μg/ml、502.5μg/ml),按 照“2.3项下”,从低浓度到高浓度连续进样,以被测物浓度(X)为横坐标,被测物的峰面积(Y)为纵坐标,按最小二乘法进行标准曲线的拟合,得标准曲线线性回归方程和线性相关系数r值。得到芦丁的回归方程Y=12155X-58108,线性相关系数r均大于0.9995。

2.4.2 精密度试验 通过测定日内及日间质控样品(芦丁对照品溶液)的峰面积相对标准偏差(RSD)来验证方法的精密度,日内精密度要求同一日内低、中、高3种浓度水平(10μg/ml、50μg/ml、250μg/ml)的质控样品连续测定6次;日间精密度要求低、中、高3种浓度水平的质控样品连续测定6d,每天测定1次。结果日内精密度RSD小于2.1%,日间精密度RSD小于3.3%,表明仪器的精密度良好,可以满足含量测定的要求。

2.4.3 重复性试验 称取同一份洋葱样品6份,按照“2.2项下”方法制备供试品溶液,按照“2.3项下”进行测定,以洋葱样品色谱图中4个黄酮类化学成分峰面积计算,4个黄酮类的精密度RSD值小于4.1%,表明该方法的重复性符合含量测定的要求。

2.4.4 稳定性试验 将洋葱样品,按照“2.2项下”方法制备供试品溶液,室温放置,分别于0、2、4、8、12、24h按照“2.3项下”测定,以洋葱样品色谱图中4个黄酮类化学成分峰面积计算,结果RSD均小于2.7%,表明供试品溶液在室温放置24h稳定性。

2.4.5 回收率试验 称取洋葱样品9份,每份各1.0g,分别精密加入芦丁对照品溶液(10μg/ml、50 μg/ml、250μg/ml)各5mL,每个浓度制备3份,置于通风橱下,待溶液挥干,按照“2.2项下”供试品溶液制备方法处理后,进行 HPLC-DAD分析,带入标准曲线,结果显示,3个浓度的回收率在95.1%~103.2%范围内,RSD小于3.7%,表明该方法能够较好的对黄酮类成分进行含量测定准确度较高。

2.4.6 最 低 检 测 限 (LLOD)和 最 低 定 量 限(LLOQ) 取标准曲线的最低浓度(5.0μg/ml)标准曲线工作溶液,用80%乙醇逐级稀释,进行HPLC-DAD分析,记录信号强度与噪音的比值,信噪比S/N≥3时的溶液浓度确定为LLOD,S/N≥10时的溶液浓度确定为LLOQ。结果该方法的最低检测限为0.3μg/ml,最低定量限为1.0μg/ml。

2.5 样品测定

取洋葱样品3份,按照“2.2项下”方法制备供试品溶液,按照“2.3项下”HPLC-DAD分析方法,将峰面积值带入相应的线性回归方程计算浓度,结果洋葱中4个主要的黄酮类化学成分的含量约为2.8mg/g。

3 讨论

本实验分别采用甲醇-水和乙腈-水,进行等度洗脱和梯度洗脱,对流动相和洗脱方式进行筛选和优化,结果表明,在乙腈-水的流动相中梯度洗脱,4个黄酮类化学成分的色谱峰的峰形和分离度均优于甲醇-水系统。因此,选择乙腈-水水作为流动相。黄酮类化学成分的极性相对较大,供试品溶液的制备过程中,采用80%乙醇溶液,提取效率较高。而提取方式方面,超声提取方法比加热回流提取方法更为方便,所以采用超声提取。一般总黄酮的含量测定,多采用分光光度法,以芦丁为对照品,但存在其他具有紫外吸收化学成分的干扰,影响含量测定结果的准确性,同时也不能提供黄酮种类的信息。本实验首先通过色谱分离,使各个化学成分获得较好的分离,而后通过二极管阵列检测器获得化学成分的紫外光谱图,推测其中的黄酮类成分,而后以芦丁为对照品,对其中的总黄酮进行定量分析,结果比较准确,能够提供洋葱中黄酮的种类信息。如果与质谱检测器联用,还可以初步推测其中可能黄酮类化学成分的结构式。

本实验建立的方法操作简便,具有优良的稳定性、精确度和重现性,能够较好的测定洋葱中总黄酮的含量,为进一步合理食用以及洋葱加工品的质量控制提供参考。

[1] 冯长根,吴悟贤,刘霞,等 .洋葱的化学成分及药理作用研究进展[J].上海中医药杂志,2003,37(7):63-64.

[2] 刘良科,赵丽娟.洋葱生物活性物质的研究进展[J].怀化学院学报,2009,28(5):55-58.

[3] 袁玲.洋葱和洋葱籽化学成分的研究[D].北京:北京协和医学院,2008.

[4] 祁英,丁江涛,苏景秀,等.洋葱中黄酮类化合物的分布及其抗氧化活性的研究[J].中国食物与营养,2010,6(5):67-71.

[5] 张强,孙玉军,储俊,等.洋葱中黄酮类化合物的提取及其体外抗氧化活性研究[J].中国食品添加剂,2009,20(3):74-79.

[6] 徐德峰,张卫明,孙晓明,等.洋葱皮中黄酮类化合物的初步分析[J].食品科技,2006,31(8):275-279.

[7] 王大力,金东日,廖世国.高效液相色谱-质谱法鉴定洋葱中黄酮类化合物[J].延边大学学报(自然科学版),2007,33(3):188-190.

[8] 张仁堂,秦静,孙欣,等.洋葱皮中黄酮类物质的提取及分离纯化研究[J].中国食物与营养,2012,18(8):50-54.

[9] 张维冰,王智聪,张凌怡.超高效液相色谱-光电二极管阵列检测-串联四级杆质谱法测定红洋葱中黄酮醇及其糖苷类化合物[J].分析化学,2014,42(3):415-422.

[10]Ren Q,Wu C S,Ren Y,et al.Characterization and identification of the chemical constituents from tartary buckwheat(Fagopyrum tataricum Gaertn)by high performance liquid chromatography/photodiode array detector/linear ion trap FTICR hybrid mass spectrometry[J].Food Chemistry,2013,136(3-4)1377-1389.

猜你喜欢

项下芦丁黄酮类
MS-DAIL联合MS-FINDER鉴定中药黄酮类化合物
货贸项下外汇业务
服贸项下外汇业务
UCP600项下电子签字剖析
信用证项下的退单争议
HPLC法同时测定白梅花中6种黄酮类成分
响应面法优化辣木中多糖和芦丁的超声提取工艺
芦丁-二甲基-β-环糊精包合物的制备、物理化学表征及体外溶出研究
葛根素、大豆素、槲皮素及芦丁体外抗氧化活性与构效关系研究
不同采收期倒地铃总黄酮及芦丁的含量变化