HPLC－DAD法测定洋葱中黄酮类含量＊

任 强 丁玉莲 王亚楠 陈 迪 付英杰 王建安

（济宁医学院药学院，山东 日照276826）

洋葱（Allium Cepa Linn）为百合科（Liliaceae）葱属，两年生草本植物，又称葱头、圆葱。药理研究表明洋葱具有消炎抑菌、抗癌、抗血小板凝聚、降血糖、降血脂和胆固醇、抗氧化等多种药理作用［1－5］。目前，对洋葱中黄酮类化学成分定量分析的研究较少［6－9］。

黄酮类化合物是植物中分布非常广泛的一类天然产物，具有特征紫外吸收光谱，在250～265nm和345～355nm有最大紫外吸收［10］。洋葱是黄酮类化合物含量较高的蔬菜之一，其中黄酮类化合物主要是黄酮醇及其苷类，主要包括槲皮素、山奈酚、槲皮素－4′－葡萄糖苷、槲皮素－3－葡萄糖苷、杨梅 黄 酮、桑 色 素 等［7，9］。 本 文 拟 采 用 HPLCDAD方法，以芦丁为对照品，对其中主要的黄酮类化学成分进行定量分析，为进一步合理食用以及洋葱加工品的质量控制提供参考。

1 仪器与实验材料

1．1 仪器

高效液相色谱仪为Shimadzu LC－20AT，配有双泵；SIL－20A 自 动 进 样 器；CTI－20AC 柱 温 箱；SPD－M20A检测器；LC solution数据处理工作站；Shimadzu VP－ODS（250mm ×4．6mm，5μm）色谱柱；电子天平（准确至千分之一，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ－500DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；溶剂过滤器（天津津腾公司）；循环水真空泵（郑州科创仪器有限公司）。

1．2 实验材料

芦丁（批号：MUST－13040302）北京恒元启天化工技术研究院＆北京世纪奥科生物技术有限公司；乙腈，色谱级，购于Burdick ＆Jackson公司；水，去离子水，购于杭州娃哈哈公司；圆葱购买日照大润发超市。

2 方法与结果

2．1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品各约10．05mg，置于10 ml容量瓶中，加80%乙醇溶液使溶解并稀释定容至刻度，摇匀，得到约1．005mg／ml的对照品储备液。用80%乙醇溶液按一定比例稀释，得到系列浓度的对照品标准曲线溶液（5．0μg／ml、10．0μg／ml、50．2μg／ml、100．5μg／ml、251．2μg／ml、502．5 μg／ml）。

2．2 供试品溶液的制备

取洋葱1．0g，精密称定，置具塞圆底玻璃试管中，精密加入80%乙醇5ml，密塞，称定重量。室温浸泡15min后，超声提取（功率100W，频率40 kHz）30min，放冷，再称定重量，用80%乙醇补足减失的重量，用0．45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2．3 色谱条件及系统适用性试验

Shimadzu VP－ODS （250mm × 4．6mm，5 μm）色谱柱；流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为0～20min 5%～95%B，20～21min 95%～5%B，21～25min 5%B；流速1ml／min；柱温30°C；检测波长为350nm；进样量20μL，上述色谱条件下，分析对照品和样品。对照品芦丁和洋葱样品色谱图分别见图1和2。

图1 对照品芦丁的色谱图

图2 样品的色谱图及4个主要黄酮类化合物的紫外光谱图

2．4 含量测定方法学验证

2．4．1 线性关系考察 将系列浓度的标准曲线样品 溶 液 （5．0μg／ml、10．0μg／ml、50．2μg／ml、100．5μg／ml、251．2μg／ml、502．5μg／ml），按 照“2．3项下”，从低浓度到高浓度连续进样，以被测物浓度（X）为横坐标，被测物的峰面积（Y）为纵坐标，按最小二乘法进行标准曲线的拟合，得标准曲线线性回归方程和线性相关系数r值。得到芦丁的回归方程Y＝12155X－58108，线性相关系数r均大于0．9995。

2．4．2 精密度试验 通过测定日内及日间质控样品（芦丁对照品溶液）的峰面积相对标准偏差（RSD）来验证方法的精密度，日内精密度要求同一日内低、中、高3种浓度水平（10μg／ml、50μg／ml、250μg／ml）的质控样品连续测定6次；日间精密度要求低、中、高3种浓度水平的质控样品连续测定6d，每天测定1次。结果日内精密度RSD小于2．1%，日间精密度RSD小于3．3%，表明仪器的精密度良好，可以满足含量测定的要求。

2．4．3 重复性试验 称取同一份洋葱样品6份，按照“2．2项下”方法制备供试品溶液，按照“2．3项下”进行测定，以洋葱样品色谱图中4个黄酮类化学成分峰面积计算，4个黄酮类的精密度RSD值小于4．1%，表明该方法的重复性符合含量测定的要求。

2．4．4 稳定性试验 将洋葱样品，按照“2．2项下”方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24h按照“2．3项下”测定，以洋葱样品色谱图中4个黄酮类化学成分峰面积计算，结果RSD均小于2．7%，表明供试品溶液在室温放置24h稳定性。

2．4．5 回收率试验 称取洋葱样品9份，每份各1．0g，分别精密加入芦丁对照品溶液（10μg／ml、50 μg／ml、250μg／ml）各5mL，每个浓度制备3份，置于通风橱下，待溶液挥干，按照“2．2项下”供试品溶液制备方法处理后，进行 HPLC－DAD分析，带入标准曲线，结果显示，3个浓度的回收率在95．1%～103．2%范围内，RSD小于3．7%，表明该方法能够较好的对黄酮类成分进行含量测定准确度较高。

2．4．6 最 低 检 测 限 （LLOD）和 最 低 定 量 限（LLOQ） 取标准曲线的最低浓度（5．0μg／ml）标准曲线工作溶液，用80%乙醇逐级稀释，进行HPLC－DAD分析，记录信号强度与噪音的比值，信噪比S／N≥3时的溶液浓度确定为LLOD，S／N≥10时的溶液浓度确定为LLOQ。结果该方法的最低检测限为0．3μg／ml，最低定量限为1．0μg／ml。

2．5 样品测定

取洋葱样品3份，按照“2．2项下”方法制备供试品溶液，按照“2．3项下”HPLC－DAD分析方法，将峰面积值带入相应的线性回归方程计算浓度，结果洋葱中4个主要的黄酮类化学成分的含量约为2．8mg／g。

3 讨论

本实验分别采用甲醇－水和乙腈－水，进行等度洗脱和梯度洗脱，对流动相和洗脱方式进行筛选和优化，结果表明，在乙腈－水的流动相中梯度洗脱，4个黄酮类化学成分的色谱峰的峰形和分离度均优于甲醇－水系统。因此，选择乙腈－水水作为流动相。黄酮类化学成分的极性相对较大，供试品溶液的制备过程中，采用80%乙醇溶液，提取效率较高。而提取方式方面，超声提取方法比加热回流提取方法更为方便，所以采用超声提取。一般总黄酮的含量测定，多采用分光光度法，以芦丁为对照品，但存在其他具有紫外吸收化学成分的干扰，影响含量测定结果的准确性，同时也不能提供黄酮种类的信息。本实验首先通过色谱分离，使各个化学成分获得较好的分离，而后通过二极管阵列检测器获得化学成分的紫外光谱图，推测其中的黄酮类成分，而后以芦丁为对照品，对其中的总黄酮进行定量分析，结果比较准确，能够提供洋葱中黄酮的种类信息。如果与质谱检测器联用，还可以初步推测其中可能黄酮类化学成分的结构式。

本实验建立的方法操作简便，具有优良的稳定性、精确度和重现性，能够较好的测定洋葱中总黄酮的含量，为进一步合理食用以及洋葱加工品的质量控制提供参考。

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