组织蛋白酶D、微血管密度在上皮性卵巢肿瘤中的表达及意义*

陕西省肿瘤医院妇瘤科(西安710061)

韩志红 方晓荷△ 田小飞



组织蛋白酶D、微血管密度在上皮性卵巢肿瘤中的表达及意义*

陕西省肿瘤医院妇瘤科(西安710061)

韩志红 方晓荷△田小飞

目的：检测组织蛋白酶D(Cath-D)、微血管密度(MVD)在上皮性卵巢肿瘤中的表达，探讨其与卵巢癌细胞组织分化、增殖、侵袭及转移的关系。方法：用Cath-D抗体标记上皮性卵巢肿瘤组织标本，综合染色强度和阳性细胞占总体细胞数的百分比进行染色判定，用CD34标记血管内皮进行微血管计数，再结合有关病理特征进行分析。结果：Cath-D、MVD均值在上皮性卵巢癌中的表达与年龄、病理类型无相关性，而与卵巢癌的临床分期、有无转移及腹水呈正相关，且Cath-D与卵巢癌的组织学分级呈正相关，Cath-D与MVD的表达具有正相关性。结论：Cath-D及MVD参与上皮性卵巢癌的发生发展过程，并在其侵袭转移及生长过程中发挥了重要的协同作用。

侵袭和转移是引起卵巢癌患者死亡的主要原因，血管生成是肿瘤生态系统中的一个重要因素，参与肿瘤的生物学行为。本研究主要探讨Cath-D与MVD在上皮性卵巢肿瘤中的表达情况及其与卵巢癌细胞侵袭转移、组织分化与增殖的关系，探寻其在卵巢癌早期诊断中的作用，并为抗癌药物的研究提供新靶点。

材料与方法

1 材 料 本研究的标本取自2002年5月至2006年3月在陕西省肿瘤医院接受初次手术治疗的患者共62例，标本经福尔马林固定，石蜡包埋，所有标本均经术后病理检查证实，术前均无化学药物治疗及毒物、药物、放射线、烟酒等危险因素接触史，其中恶性组40例，良性组12例，交界恶性4例，正常组织6例。按国际妇产科协会(FIGO)2004年分期标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期10例，Ⅲ期11例，Ⅳ期11例；按组织病理分级，1级2例 ，2级23例，3级15例；按组织学类型分类(WHO1998年分类法)，浆液性26例，粘液性18例。良性卵巢上皮性肿瘤共12例，浆液性6例，粘液性6例。正常卵巢6例作为对照组，均来自因子宫肌瘤行全宫切除术同时切除卵巢的病例。鼠抗人组织蛋白酶D单克隆抗体、鼠抗人原始造血细胞(CD34)单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 方 法 ①免疫组织化学染色SP法(链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连接法)：石蜡切片脱蜡至水,PBS缓冲液冲洗，抗原热修复后加过氧化酶阻断溶液,PBS冲洗后再加入非免疫性动物血清，室温孵育10 min加入第一抗体，4℃过夜。PBS冲洗后加生物素标记的第二抗体,室温孵育10min后PBS冲洗，再加入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液,室温孵育10 min,PBS冲洗后滴加新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3～10 min。自来水冲洗，复染,脱水,封片。用PBS缓冲液代替一抗作为空白对照。②结果判定：Cath-D的阳性判断标准为：凡细胞胞质内出现棕色颗粒为阳性，双盲法随机选5个高倍(400倍)视野计算100个细胞中阳性细胞数，阳性细胞>50%为阳性表达，<50%为阴性表达。MVD计数标准参考Weidner的矫正计数法：以被CD34染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇为一个血管标记，凡管腔大于8个红细胞的血管均不计数，先在低倍镜下(100倍)选取5个微血管最密集的区域，再在高倍镜(400倍)下计数每个区域微血管数量，以平均值表示每例的MVD值[1]。

3 统计学方法 应用SPSS13.0统计分析软件，Cath-D采用χ2检验。MVD采用t检验，Cath-D与MVD的相关关系采用相关性分析，取α=0.05作为检验水准。

结 果

1 Cath-D及MVD在正常卵巢组织及上皮性卵巢肿瘤中的表达情况 Cath-D染色阳性物质呈棕黄色细颗粒，主要定位在卵巢癌的癌细胞和间质细胞的的细胞浆和细胞膜中，细胞核不着色(见附图)。其表达在恶性组最高，良性组最低，恶性组分别与正常组、良性组、交界性组间有显著性差异(P<0.05)。CD34标记的MVD阳性表现为棕黄染色，在癌组织或癌周均可见，但在癌周特别丰富(见附图)，MVD均值在良性组与交界及恶性组之间有显著性差异(P<0.05)。

2 Cath-D、MVD的表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系 Cath-D在卵巢肿瘤中的表达与年龄和组织学类型无明显关系(P>0.05)；而在FIGO分期晚(Ⅲ～Ⅳ期)、组织学分化程度低、体内有腹水或发生转移病例中其表达程度增高，其间有显著性差异(P<0.05)。而MVD的表达与组织学分级无关(P>0.05)，见附表。

A：Cath-D在卵巢浆液性囊腺癌中的表达(10×40倍)；B：Cath-D在卵巢粘液性囊腺癌中的表达(10×40倍)；C：MVD在卵巢浆液性囊腺瘤中的表达(10×10倍)；D：MVD在卵巢粘液性囊腺瘤中的表达(10×10倍)

附图 上皮性卵巢癌中Cath-D、MVD的阳性表达(免疫组化SP法)

附表 Cath-D的表达与卵巢癌中的阳性表达与临床病理指标间的关系

3 Cath-D和MVD表达的相关性 在Cath-D表达阴性的21例上皮性卵巢癌和Cath-D表达阳性的19例上皮性卵巢癌中，MVD均值具有表达的正相关性，并具有显著性差异(P<0.05)。

讨 论

Cath-D是一种天门冬氨酸肽链内切酶，编码基因位于染色体11p15，广泛存在于脊椎动物、真菌、反转录病毒和一些植物病毒中。人体正常组织均能合成Cath-D，其正常功能是在溶酶体的酸性pH环境下分解蛋白质，它也有类似生长因子的作用。除此以外，有研究表明，Cath-D与细胞凋亡密切相关[2]。有报道在胃癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、脑星形胶质细胞瘤和各种妇科肿瘤等恶性肿瘤中都曾发现Cath-D的过表达与恶性肿瘤的临床分期、病理分级和肿瘤浸润程度以及复发有相关联系[3-4]。因此如何利用Cath-D来预防和治疗癌症给人类带来新的思考[5]。

本研究结果显示：Cath-D的表达与卵巢癌的FIGO分期、组织学分化程度、有无转移及有无腹水有关，临床分期越高、组织学分化程度越低Cath-D的表达越强，发生转移及产生腹水者其Cath-D表达程度增强。提示Cath-D参与了卵巢癌的侵袭、转移过程。Cath-D促进肿瘤进展、浸润转移的可能机制是：过表达的Cath-D激活蛋白质水解级联反应，降解基底膜的多种组织成分，使基底膜破坏，肿瘤细胞穿过基底膜从而浸润转移，可以以同样的方式溶解血管的基底膜进入血管，从而发生远处转移。既往有报道在上皮性卵巢肿瘤中，有组织蛋白酶B、基质金属蛋白酶等溶酶体酶类的活跃表达，因此Cath-D是与其它溶酶体酶类协同发挥作用。

许多学者将MVD作为肿瘤血管形成程度的标志和肿瘤的生物学特征[6]，可作为肿瘤转移的预测因子及判断预后的指标[7]。关于MVD的测定及其与肿瘤生长、病理分期、转移及预后有关，本研究显示，MVD表达与卵巢癌的FIGO分期、有无转移及有无腹水有关，临床分期越高MVD的表达越强，发生转移及产生腹水者其MVD表达程度增强，而与组织学分级没有明显关系。由本研究的结果和以往多位学者的报道我们推测，血管生成为肿瘤细胞的生长提供营养和氧气。微血管密度增高是肿瘤整体血管面积增大，肿瘤细胞进入血道或淋巴结循环的机会增大，从而使远处转移的机会增大。MVD 的检测不仅能反映卵巢癌组织内血管的数量，还能反映卵巢癌细胞生长和转移的能力，有助于深入了解肿瘤发生、发展和转移的机制，是判断卵巢癌患者预后的一项有用指标。除此之外，MVD还为抗肿瘤血管生成治疗提供理论基础，如果能找到抑制和阻断血管形成的途径，就可使原发的甚至转移的肿瘤得到有效的控制，将对恶性肿瘤的治疗提供一种新的途径。

在Cath-D表达阳性的上皮性卵巢肿瘤组织中，MVD均值较Cath-D表达阴性的肿瘤组织中高，用统计软件对Cath-D和MVD之间进行相关性分析，发现二者有正相关性。这两项指标之间的调控机制目前尚不甚清楚，认为可能是Cath-D刺激肿瘤细胞释放碱性成纤维细胞生长因子所致。

综上所述，过表达的Cath-D和MVD可促进上皮性卵巢癌的发生和发展，有利于上皮性卵巢癌的浸润和转移，可以判断上皮性卵巢癌的恶性程度、生物学行为及预后， Cath-D、MVD的表达在上皮性卵巢癌的分化、侵袭、转移和临床进展过程中可能起着重要调节作用，为研究上皮性卵巢癌的发病机制、侵袭转移、预测预后以及探讨治疗提供了一种新的途径。

[1] Foote RL,Weidner N,Harris J,etal.Evaluation of tumor angiogenesis measured with microvessel density (MVD) as a prognostic indicator in nasopharyngeal carcinoma: results of RTOG 9505[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,61(3)：745-753.

[2] Kagedal K,Johansson U, Ollinger K.The lysosomal protease cathepsin D mediates apoptosis induced by oxidative stress[J]. EMBO,2001,15：1592-1594.

[3] Ruibal A,Herranz M, Arias JI. Clinical and Biological Significance of Cathepsin D Levels in Breast Cancer Cytosol in Women Over 70 years[J].Biomark Cancer,2012,8(4)：1-6.

[4] Mimae T,Tsuta K,Maeshima AM,etal.Cathepsin D as a potential prognostic marker for lung adenocarcinoma[J]．Pathol Res Pract,2012,208(9)：534-540.

[5] Achour O,Bridiau N,Kacem M,etal．Cathepsin D activity and selectivity in the acidic conditions of a tumor microenvironment：Utilization in the development of a novel Cathepsin D substrate for simultaneous cancer diagnosis and therapy[J]．Biochimie,2013,95(11)：2010-2017.

[6] Scappaticci FA. Mechanisms and future directions for angiogenesis-based cancer therapies[J]. Clinical Oncology,2002,20(18)：3906-3927.

[7] Romanenko AM,Ruiz-Saurí A,Morell-Quadreny L,etal.Microvessel density is high in clear-cell renal cell carcinomas of ukrainian patients exposed to chronic persistent low-dose ionizing radiation after the Chernobyl accident[J].Virchows Archiv,2012,460(6)：611-619．

(收稿：2015-06-08)

*陕西省自然科学基础研究项目(S2013JC10400)

卵巢肿瘤 组织蛋白酶D 微血管密度 肿瘤转移

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.007

△广东省深圳市宝安区妇幼保健院妇产科