口腔医学中组织工程骨修复骨量不足的研究进展

朱彪 赵刚 郭希民 郭红延

口腔医学中组织工程骨修复骨量不足的研究进展

朱彪 赵刚 郭希民 郭红延

在口腔医疗实践过程中，常遇到骨量不足的问题。目前，临床应用的植骨材料包括自体骨、异体骨、异种骨和生物医学材料等，每种植骨材料均有其特定的优势但又存在着各自的不足。近年来，随着组织工程学的发展，使组织工程骨替代传统植骨材料用于修复口腔颌面部的骨量不足成为可能。本文就目前在此方面的科研和临床研究进展作一综述。

组织工程；骨移植；口腔医学

在进行修复颌骨、腭骨的骨缺损，填补种植体周围骨间隙，提升过低的上颌窦底等手术时，经常会遇到术区骨量不足的情况。它增加了手术风险，降低了手术成功率。为解决此类问题，许多人尝试着将移植技术应用到口腔医学领域，并且取得了一些进展。在众多的移植材料中，组织工程骨有可能是最有前途的发展趋势[1]。

组织工程学是应用工程学和生命科学的基本原理，以生物体结构与功能的相互关系为指导，来构建能修复、维持或者改善病损组织或器官功能生物替代物的一门新兴交叉学科。传统意义上的组织工程骨，包括种子细胞、生长因子和支架材料三部分。其移植策略是将机体细胞经体外扩增获得种子细胞，并与生物活性因子和载体材料复合，再植入到体内的缺损部位。种子细胞在生长因子的参与下生长形成再生组织。与此同时，支架材料同步降解吸收。口腔医学中骨组织工程研究是人体组织工程学研究的一个重要组成部分。

1 种子细胞

组织工程骨的基础-种子细胞是一种干细胞，这种干细胞具有增殖和分化为不同种系细胞的潜能。按照分化阶段的不同，干细胞可分为胚胎干细胞（embryonic cell，ESC）和成体干细胞（adult stem cell，ASC）两大类。ESC又称全能干细胞，几乎可以分化为机体所有类型的细胞。理论上讲它可以为组织工程骨提供充足的细胞来源，但是凡事有利必有弊，正是因为其具有全能性，如何使其稳定地向成骨细胞方向分化，而又不发生变异是一个问题。另外在体外培养时获得纯化的ESC是有难度的。因其涉及伦理道德问题，使其临床应用也极大地受限了。

由于ESC具有这些缺点，限制了其在科研和临床中的应用。ASC便历史性地成为了骨组织工程研究的主力军。ASC主要有骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）、脂肪基质干细胞（adpose derived stromal cell，ADSC）、脐血干细胞[2]、系列的产前干细胞、骨骼肌干细胞、牙髓干细胞和牙周膜干细胞等。其中BMSC因具有取材方便、容易分离、体外倍增时间短、安全稳定、无伦理争议等优点，在组织工程领域已被广泛应用。而且有一项骨组织工程中不同干细胞成骨能力的研究表明：人BMSC比ADSC和脐带干细胞的碱性磷酸酶染色阳性率更高[3]。它在不同条件下可以向骨、脂肪、软骨、骨骼肌、真皮、神经等组织方向分化[4]。并且在一定范围内，ASC的接种密度和新骨形成量之间存在剂量反应关系。Pieri等[5]研究不同剂量的兔脂肪干细胞复合无机牛骨支架材料对兔颅骨骨缺损区骨量形成和该区种植体骨整合的影响，结果显示：脂肪干细胞的接种密度和新骨形成量之间存在数量反应关系。总体来看，随着脂肪干细胞密度的增加，种植体周围新骨形成量也增多。在研究兔后外侧脊柱结合率的实验中，也观察到了类似的数量反应关系[6]。在此项研究中，高量BMSC（1×108）与多孔羟基磷灰石材料复合组比低量BMSC（1×106）组的结合率更高，新骨形成量也更多。

然而在实际的临床应用中，说服患者为了完成种植牙而抽取自身的骨髓或者脂肪等干细胞含量丰富的组织是有难度的。而诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPS）有望应用于组织工程骨的构建。iPS和ESC在很多方面都相似，但是这两种类型的细胞又有着本质上的不同[7]。Miura等[8]研究证实，小鼠的诱导多能干细胞比小鼠的胚胎干细胞具有更低的畸胎瘤形成率。

2 生长因子

种子细胞的生存状态、骨基质的分泌、分裂和分化等都受到生长因子的调节。尽管目前对这些调节的确切机制还不是很清楚，但是生长因子的确是细胞调节重要的物质基础。现已明确在骨形成过程中发挥重要作用的生长因子主要有骨形成蛋白（bone morphogenic proteins，BMPs）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等。

机体正常骨缺损愈合是通过多种生长因子协同发挥作用来实现的，单一生长因子的作用有限。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）因含有多种能促进骨组织愈合的生长因子，而被研究者所重视。而且PRP中这些生长因子的浓度比较高，各种生长因子的比例也与机体相似，可以通过生长因子调节网络发挥作用。Kanno等[9]研究PRP对人成骨样细胞增殖与分化的影响，在80 d的实验周期内，实验组细胞的增殖活性和细胞外基质合成量均明显高于对照组。

但是自PRP应用以来，对其安全性和稳定性的争议就一直不断。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）开始进入研究者的视线。PRF所含生长因子与PRP相似，但是在其制备过程中不需要加入异种血液制品，并且PRF具有纤维蛋白立体结构，可以使生长因子相对稳定地保存于其中。Toffler等[10]单独将PRF作为移植材料应用于上颌窦底提升术中。选择了患者

110例，术前平均窦底高度为6.6mm(4.0～8.0mm)。术中仅加入PRF，然后共植入种植体138枚，种植位点骨高度平均增加了3.4 mm(2.5～5.0 mm)。术后11个月，仅3枚种植体脱落，初期保存率为97.8%。

同样为了使生长因子稳定地保存于组织工程骨中发挥作用，基因工程技术也被应用于骨组织工程领域了。叶展超等[11]用携带BMP-2基因的腺病毒转染犬骨MSCs，再与Bio-Oss支架材料复合构建组织工程骨用于犬上颌窦底提升的手术。与没有基因强化犬MSCs相比：实验组的新生骨量(24.74±6.33)mm2明显多于对照组的(19.67±5.73)mm2。

3 支架材料

骨组织工程的支架材料提供了种子细胞黏附、营养物质交换、生长、分裂和分化等的外部微环境，是组织工程骨的基本框架。因为机体的骨组织经过长期的进化选择，其结构与功能是相对完善的。所以自体骨是天然的骨移植修复的支架材料。但是由于其具有来源有限，需要开辟第二术野以及对第二术区的继发影响等缺点，限制了其临床应用。支架材料经历了单一支架材料、复合支架材料、分层支架材料，目前的发展趋势是三维网络支架材料。从不可降解材料到可降解材料，从生物惰性材料到生物活性材料，支架材料已经越来越接近理想的骨修复支架材料了。各种支架材料各有其优缺点，在实际的科研或临床应用中可以根据这些材料的特点选择应用。

目前，科研或临床常用的单一支架材料主要有生物衍生材料（PRP、PRF、异种脱细胞真皮基质、珊瑚、去细胞的异体骨或者异种骨等）和生物替代材料（β-磷酸三钙、羟基磷灰石、壳聚糖、胶原、聚乳酸羟基乙酸、生物玻璃等）两大类。许多通过自然聚合或者生物降解与合成的多孔支架材料已经应用于组织工程领域了。如周庆梅等[12]采用离子凝胶制备纳米微球，微球形态良好，分散度好，无粘连，粒径分布以380～650 nm居多。以其作为骨组织工程的支架材料，利于细胞的黏附、伸展、增殖和分化等。

单一材料可能具有无骨诱导性、亲水性差、机械强度不足等不符合支架材料特性要求的缺点，而由不同比例构成的复合材料可以集中两种或者两种以上材料的优点，又在一定程度上弥补它们的不足。Takagi等[13]研究用壳聚糖和磷酸三钙制备支架材料复合体，其理化性质与人体骨组织较为接近。

支架材料的设计追求的是模拟天然组织的结构与功能，而支架材料的分层设计有可能促进组织的再生。因此立体控制多种异型细胞相互作用的分层支架材料可以支持整体多组织共同体的形成[14]。

比分层支架材料更靠近历史前沿的是个体化设计的三维网络支架材料。从形式上看，它与患者骨缺损部位的大小和形状相一致；从内容上看，其内部复杂的网络结构能够支持组织工程骨植入前的预先血管化。

目前应用组织工程骨修复小面积骨缺损的二维支架材料不需要实现支架材料移植前的预先血管化。其内部的种子细胞可以通过周围毛细血管的弥散作用而获得生存所必需的养分和氧气等，新生血管床也可以从组织工程骨移植物的边缘区域长入[15]。然而目前用二维支架材料的组织工程骨修复大段骨缺损仍然是十分困难的。究其原因，在很大程度上是因为二维支架材料不能保证大段支架材料中心区域种子细胞所必须的营养成分和氧气持续供给，温度和pH值的恒定等。而预先血管化的三维支架材料组织工程骨有可能解决这一难题。

这样矛盾的焦点就转移到如何才能实现三维支架材料的预先血管化上了，而利用机体自身已经形成的血管网络是一种可能的途径。例如：把支架材料复合到血管网络上，再利用显微血管外科的技术手段将此组织工程骨移植到骨缺损区。

以内皮细胞和成骨细胞的共培养来形成血管网络是另一种可能的途径。这就需要支架材料能够被复制成同样复杂的网络结构。如果再考虑上细胞与细胞之间，细胞与细胞外基质之间复杂的相互关系，那么设计这种支架材料将会更加困难。归纳一下目前文献已报道的复制这种三维支架材料的方法主要有：（1）生物体组织的去细胞化[16]；（2）激光介导细胞植入血管样的网状结构[17]；（3）设计内含微隧道结构的支架材料[18]。

4 展望与不足

尽管在动物模型中用组织工程骨修复颌骨骨量不足是可行的，但是能否用组织工程骨修复人颌骨骨量不足仍需用大量的实验来证实[19]。如果能用组织工程骨修复人颌骨骨量不足，同样需要用大量实验来验证的是组织工程骨在机体内的转归及其远期疗效如何。在组织工程骨真正应用于临床之前，我们还需要进一步理解骨组织的生长发育过程，骨组织结构与功能的相互关系，骨组织受创伤后缺损的自然愈合的确切机制，甚至生物力作用对骨组织修复的影响等。

种子细胞是骨组织工程的基础，但是我们需要进一步证实是否是种子细胞在形成骨基质时起作用或者说它的作用有多大。因为骨缺损的边缘区同样会有机体自身干细胞存在，它是否起作用。如果也起作用，在多大程度上起作用。

既然种子细胞的密度和新骨形成量之间存在剂量反应关系，那么是否意味着我们继续加大接种种子细胞的密度，骨量形成会更多；还是存在一个接种细胞密度的最优峰值，如果我们接种比峰值更大细胞密度，骨量形成反而减少。这些疑问尚且需要接种更广范围的细胞密度来进一步解决。

生长因子的应用是一把双刃剑，我们在应用生长因子诱导成骨时也不能忽略其不可避免的副作用。例如：BMP的应用可能会带来一系列的并发症，包括致癌性[20]。那么是否存在一个最适浓度，应用这一浓度的生长因子既能保证有效诱导成骨，又能尽量把其副作用降到最小。对于不同的生长因子、欲应用的不同物种而言，这个最适浓度是否会有差异，每种情况的最适浓度又是多少。能否将生长因子的缓释系统或者控释与支架材料有机结合，使生长因子始终以最适浓度作用于种子细胞。

口腔颅颌面部诸骨具有较为复杂的解剖生理结构，这无疑增加了支架材料的设计制作难度。而目前的支架材料尚不能满足骨组织工程支架材料的要求，因此我们期待着更接近于自体骨支架材料的问世。

骨组织的生理结构、营养代谢与功能等相比机体其它组织要简单得多，因此组织工程骨很有可能是第一个应用于临床的组织工程产品。但在这之前，我们仍有许多工作要做。

[1] Kenar H,Kose GT,Hasirci V,et al.Tissue engineering of bone on micropatterned biodegradable ployester films[J].Biomateria ls,2006,27(6):885-895.

[2] Ohta S,Yamada S,Matuzaka K,et al.The behavior of stem cells and progenitor cells in the periodontal ligament during wound healing as observed using immunohistochemical methods[J].Periodental Res,2008,43(6):593-603.

[3] Yong W,Baoqi J,Jun C,et al.Superior osteogenic capacity of different mesenchymal stem cells for bone tissue engineering[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol,2013,116(5):324-332.

[4] Chamberlain G,Fox J,Ashton B,et al.Concise review:Mesenchymal stem cells:Their phenotype，differentiation capacity，immunological features，and potential for homing[J].Stem Cells,2007,25(11):2739.

[5] Pieri F,Lucarelli E,Corinaldesi G,et al.Dose-dependent effect of adipose-derived adult stem cells on vertical bone regeneration in rabbit calvarium[J].Biomaterials,2010,31(13):3527-3535.

[6] Minamide A,Yoshida M,Kawakami M,et al.The use of cultured bone marrow cells in type I collagen gel and porous hydroxyapatite for posterolaeral lumbar spine fusion[J].Spine,2005,30(10):1134-1138.

[7] Robinton DA,Daley GQ.The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy[J].Nature,2012,481(7381):297-298.

[8] Miura K,Okada Y,Aoi T,et al.Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines[J].Nature Biotechnol,2009,27(8):743-745.

[9] Kanno T,Takahashi T,Tsujisawa T,et al.Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation[J].J Oral Maxillofac Surg,2005,63(3):362-369.

[10] Toffler M,Toscano N,Holtzclaw D.Osteotome-mediated sinus floor elevation using only platelet-rich fibrin:an early report on 110 patients[J].Implant Dent,2010,19(5):447-456.

[11] 叶展超，张文斌，陈晓莉，等.基因强化组织工程骨用于上颌窦提升的动物实验[J].中华口腔医学杂志，2012，47(2):114-117.

[12] 周庆梅，孙健，李亚莉，等.生长因子缓释系统复合纳米支架材料修复犬下颌骨缺损[J].中国组织工程研究，2013，17(21)：3816-3822.

[13] Takagi S,Chow LC,Hiragma S,et al.Properties of elaotomeric calcinm phosphate cement-chitosan composites[J].Bent Material,2003,19(8):797-804.

[14] Lu HH,Thomopoulos S.Functional attachment of soft tissues to bone:development,healing and tissue engineering[J].Annu Rev Birmed Eng,2013,15:201-226.

[15] Eweida AM,Nabawi AS,Marei MK,et al.Mandibular reconstruction using an axially vascularized tissue-engineered construct[J].Ann Surg Innov Res,2011,5:2.

[16] Ott HC,Matthiesen TS,Goh SK,et al.Perfusion-decellularised matrix:using nature’s platform to engineer a bioartifical heart[J].Nat Med,2008,14(2):213-221.

[17] Nahmias Y,Schwartz RE,Verfaillie CM,et al.Laser-guided direct writing for three-dimensio tissue engineering[J].Biotechnol Bioeng,2005,92(2):129-136.

[18] Choi NW,Cabodi M,Held B,et al.Microfluidic scaffolds for tissue engineering[J].Nat Mater,2007,6(11):908-915.

[19] Meijer GJ,Bruijn JD,Koole K,et al.Cell based bone tissue engineering in jaw defects[J].Biomaterials,2008,29(21):3053-3061.

[20] Woo EJ.Adverse events reported after the use of recombinant human bone morphogenetic protein 2[J].Oral Maxillofac Surg,2012,70(4):765-767.

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.4.004

北京 100039 武警总医院口腔医学中心 （朱彪 赵刚 郭希民郭红延）

郭红延 E-mail：ghyfmmu@126.com