四氯化碳诱导兔肝纤维化模型的改良

侯洪伟，潘峥，2，陈敏，徐佳佳，李卫民，嵇振岭，2

(1.东南大学医学院，江苏南京 210009； 2.东南大学附属中大医院普外科，江苏南京 210009；3.东南大学附属中大医院病理科，江苏南京 210009)

·论 著·

四氯化碳诱导兔肝纤维化模型的改良

侯洪伟1，潘峥1，2，陈敏1，徐佳佳3，李卫民1，嵇振岭1，2

(1.东南大学医学院，江苏南京 210009； 2.东南大学附属中大医院普外科，江苏南京 210009；3.东南大学附属中大医院病理科，江苏南京 210009)

目的：通过改良传统四氯化碳(CCl4)法诱导兔肝纤维化模型，提高以肝纤维化模型为基础的相关研究的实验效率及动物模型质量。方法：选取50只健康雄性新西兰大白兔，每批25只。首批实验(传统组)将动物随机分为两组，造模组21只，皮下注射50% CCl4橄榄油溶液，每周两次；对照组4只，相同方法皮下注射纯橄榄油，注射12周，观察记录兔一般情况。造模组于0、4、8、12周行影像学及血清学生化指标检测，每次采血后随机处死7只兔(兔意外死亡时按剩余数量均分计)，测门静脉压(PVP)并取组织行HE、Masson、免疫组化染色及ISHAK评分；对照组12周后处死大白兔，其余处理同造模组。针对第1批实验中暴露的问题进行改良，将改良方案应用于第2批(改良组)实验。结果：传统造模组及改良造模组动物死亡率分别为42.9%和9.5%，造模成功率分别为57.1%和85.7%，两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。改良组兔体重、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶、白蛋白、总胆红素与对照组相比随实验进行出现差异有统计学意义的变化(P<0.05)；造模组12周时门静脉血流速度较对照组减慢，螺旋CT扫描显示造模组肝实质密度较对照组降低，HE、Masson及免疫组化染色可见肝实质发生明显纤维化改变并可见假小叶形成，造模组4、8、12周时ISHAK评分分别为(1.33±0.52)、(1.83±0.75)、(4.17±0.75)分。结论：通过对CCl4诱导兔肝纤维化模型的传统造模方案进行针对性改良，可在保证造模成功率的基础上降低动物死亡率，为以动物肝纤维化模型为基础的实验研究打下良好基础。

肝纤维化； 肝硬化； 兔； 动物模型； 四氯化碳

肝纤维化是肝脏针对几乎所有病因引起的慢性损伤的修复反应，早期肝纤维化可以限制损伤因素的扩散，对肝脏起到一定的保护作用；但在持续的病理因素刺激下肝纤维化持续发展，最终将导致其终末期改变——肝硬化的发生[1]。肝脏纤维化发展呈渐进性，相关研究表明早期变化可逆转[1-3]，但终末期肝硬化逆转困难。因此，及时阻止纤维化的发展对于慢性肝脏疾病的治疗极其重要，而肝纤维化动物模型的建立是人类肝脏疾病研究的重要前提[4]。

目前大量的肝纤维化相关研究都基于鼠类模型[5-8]，但由于鼠类体积小、血量少、生命力较差的缘故不适于长期的血清学、影像学及形态学研究，而兔可以很好地克服这些不足。本研究采用新西兰大白兔作为模型载体，通过持续皮下注射四氯化碳(CCl4)溶液诱导兔肝纤维化模型，并对兔的一般情况、血清学、形态学及病理学等方面的特点进行观察研究，通过改进传统造模流程，在保证造模成功率的基础上最大程度地降低动物死亡率，为以肝纤维化为前提的实验研究提供较理想的造模方案。

1 材料与方法

1.1 试剂

CCl4(分析纯)和橄榄油(南京化学试剂有限公司)取等量配成50%混合溶液，常温密封保存备用。平滑肌肌动蛋白(α-sma)一抗(英国Abcam)，Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)一抗(北京博奥森)，HRP-山羊抗小鼠二抗及HRP-山羊抗兔二抗(美国KPL)。

1.2 动物

健康新西兰大白兔50只，雄性，体质量2.20～2.78 kg，4月龄，由江苏省农业科学院种兔场提供，全部通过检验检疫，饲养于东南大学医学院动物实验中心，提供兔专用饲料，自来水饮水，自然生长1周，1周后进行分组实验。

1.3 肝纤维化模型建立

1.3.1传统组方案 传统组造模注射剂量及频次在参照相关文献描述[5-6,9]的基础上，决定采取50%浓度、1 ml·kg-1、每周两次皮下注射方式，连续注射12周。

1.3.2改良组方案 (1) 注射剂量：初始剂量降至0.5 ml·kg-1，浓度不变；(2) 由单点注射改为多点皮下注射，一次剂量同一日内分两次注射，间隔不小于8 h；(3) 根据动物一般状态调整注射剂量，良好者可按0.5 ml·kg-1递增，上限3 ml·kg-1，若动物出现拒食、活动减少等中毒现象，酌情减少用量或停注1～2次；(4) 采用动物来源地相同饲料，实验开始时间选在较为温暖的4月。

1.4 血生化检查

于0、4、8、12周末经兔耳中央动脉采血。生化检查项目包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、前白蛋白(PALB)、碱性磷酸酶(ALP)。

1.5 影像学检查

进行相关检查前动物禁食12 h，禁水6 h，耳缘静脉推注1%戊巴比妥4 ml·kg-1麻醉，行常规腹部CT检查及彩色多普勒超声检查。

1.6 组织染色及病理分级

造模组于4、8、12周末分别用过量麻醉法处死7只兔(兔意外死亡时按剩余数均分计算)，观察肝脏外观变化情况，行HE、Masson及免疫组化(α-sma及Col-Ⅰ)染色，镜下观察肝组织变化情况，并采用ISHAK标准[10]进行组织学评分。

1.7 门静脉压(PVP)测量

经肠系膜上静脉分支穿刺插管至门静脉，水柱测压计测量PVP[11]。

1.8 统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行数据处理，数据以均数±标准差表示，血清生化指标采用单因素方差分析进行比较，死亡率采用Fisher精确概率法比较，体重数据组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

因传统组死亡率高无法统计，以下独立数据均取自改良组。

2.1 造模方案改良前后成功率及死亡率比较

传统组造模兔21只，非正常死亡9只，死亡率42.9%；改良组造模兔21只，非正常死亡2只，死亡率9.5%，12周时传统组及改良组分别有12只及18只兔成功达到了早期肝硬化状态(ISHAK≥4分)，成功率分别为57.1%和85.7%；两组中动物主要死亡原因为拒食拒饮，4周内是死亡高峰期(图1)。

2.2 一般情况

对照组兔机警性高，对外界声光刺激反应迅速，活动较频繁，食欲好，进食量较大，体重增长迅速，毛发浓密有光泽；造模组兔随注射时间增加，对外界刺激反应逐渐迟缓，活动减少，进食水量减少，毛发蓬乱无光泽，少数毛发脱落较严重；药物注射后4周内时间段动物药物不良反应明显，出现体重下降及拒食现象，甚至出现急性中毒死亡。对照组兔体重随时间呈递增趋势，且8、12周与0周比较差异有统计学意义(P<0.05);造模组兔体重未见明显改变；0周时两组兔体重间差异无统计学意义，4、8、12周时对照组兔体重明显高于造模组(P<0.05)(图2)。

aP<0.05

图1 12周时传统组与改良组兔死亡率及造模成功率比较

Fig 1 Comparison of mortality of rabbits and success rate of modeling between traditional patch and modified patch at 12th week

a 组内不同时间点兔体重与0周比较,P<0.05; b 同一时间点兔体重组间比较,P<0.05

图2 改良造模组与对照组兔体重随时间变化情况

Fig 2 Comparison of changes of weights in rabbits in modeling group of modified patch and control group

2.3 血清生化检查结果

注射CCl44周后ALT、AST较0周明显增高，并维持于较高状态；ALB呈降低趋势，12周与0周比较差异有统计学意义；TBil呈波动性变化，其中4周时升高明显;其余指标各时间点未见明显变化(表1)。

2.4 影像学检查结果

彩色多普勒超声(图3a、b)示：a为对照组肝脏图像，b为造模组12周时肝脏图像，两者肝实质回声比较未见明显变化，但造模组兔门静脉血流速度(12.8 cm·s-1)较对照组(23.0 cm·s-1)明显减慢；CT(图3c、d)示：c、d分别为对照组及造模组12周时兔肝脏断面图像，其中d图像肝脏断面平均CT值54 HU，明显低于对照组94 HU，肝脏密度降低，提示造模组在形成肝纤维化的同时可能伴有不同程度的肝脂肪变性。

2.5 PVP变化

整个试验过程中动物PVP呈进行性升高趋势，但变化差异无统计学意义(P>0.05)。

不同时间点数据与0周时比较：aP<0.01; bP<0.05

图3 改良后对照组(a、b)与造模组(c、d)12周时兔彩色多普勒及CT检查结果

Fig 3 Color Doppler flow imaging and CT scan of rabbits of control group and modeling group in modified group

2.6 组织外观、病理学检查及ISHAK分期

0周时：肝脏色泽红润，表面光滑，质地柔软，HE及Masson染色可见肝细胞索排列整齐，无明显炎细胞浸润，肝小叶结构清晰，肝血窦以中央静脉为中心呈放射状排列，肝实质免疫组化未见明显Col-Ⅰ及α-sma异常表达；12周时：造模组兔肝脏外观呈浅棕色，表面凹凸不平，有小结节样改变，质地硬，HE染色可见部分肝细胞空泡样脂肪变性，正常肝小叶结构破坏伴纤维间隔形成，肝细胞索排列紊乱，伴炎症细胞浸润，可见部分假小叶形成；Masson染色可见汇管区胶原纤维明显增生，形成纤维间隔，包绕、分割正常肝组织，假小叶形成；免疫组化可见汇管区及纤维间隔中Col-Ⅰ及α-sma表达明显升高(图4)。造模组4、8、12周时ISHAK评分分别为(1.33±0.52)、(1.83±0.75)、(4.17±0.75)分，提示随着造模时间延长，肝纤维化程度呈递增改变。

A、B、C、D分别代表肝脏组织HE染色、Masson染色、免疫组化标记Col-Ⅰ及α-sma镜下表现； 1、2分别代表0周和12周

图4 改良后造模组0周与12周时兔肝脏组织病理学变化比较 ×100倍光镜

Fig 4 Histopathologic comparison between 0 and 12 weeks of modeling group in modified patch(Magnification:×100)

3 讨 论

目前对于肝纤维化机制的理解很大程度上依赖于对动物模型的研究。良好的动物模型应该能够模拟人类疾病的形态学、组织学的渐进性变化，并且具有较好的可重复性及低死亡率，能够产生可逆及不可逆性的病理生理学结局[12]。将动物种属及造模方法合理搭配形成最优化的造模方案，是保证各项相关研究顺利进行的基础。

在肝纤维化模型制作方面，国内外相关研究主要讨论的问题包括动物的选择、造模方式及与研究内容的相关性等。George等[13]通过腹腔注射DMN法成功制作出了小鼠肝硬化模型，指出DMN法制作小鼠肝纤维化模型可为人类肝硬化的研究提供可重复及有价值的动物模型平台，但其实验动物14 d 25%及21 d 42%的高死亡率阻碍了后续研究的实施。Chang等[14]将肝毒性药物法与结扎胆总管法制作鼠类肝硬化模型相比较，指出结扎胆总管法造模时间短，但同样面临动物死亡率高的问题，适用于短期研究；CCl4法造模的时间及动物死亡率与药物剂量及注射方式有关，可用于急慢性肝纤维化研究。Ding等[4]通过皮下注射CCl4在16周时诱导出猴肝硬化模型，成功率75%，他指出由于生理相似性，灵长类动物更适用于人类相关疾病研究的动物模型。陈刚等[15]通过皮下注射CCl4法成功诱导大鼠肝纤维化模型，但仍有20%的较高动物死亡率。

CCl4具有选择性的肝脏毒性，长期注射可诱导肝纤维化，其引起肝细胞损害的重要原因是CCl4导致膜脂质过氧化或与蛋白质的巯基反应[12]。大量研究[3,16-17]表明，HSC表型改变导致了纤维化过程中ECM的过度沉积；同时胶原蛋白酶合成减少[18]及基质金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)表达失调导致ECM的分解减少也是肝纤维化发展的重要原因。由于具有多种给药途径、可重复、组织学变化相对连续等优点，CCl4可作为肝纤维化模型较为理想的诱导剂。

血清生化指标是检测肝脏损伤程度的重要手段：ALT血液中浓度升高与肝细胞损伤、肝细胞膜通透性增高有关，AST反映肝细胞内线粒体损伤程度，ALB是反映肝脏整体合成功能的重要指标。在纤维化的肝组织中Col-Ⅰ由肌成纤维细胞大量分泌，主要存在于富含肌成纤维细胞的纤维隔膜的中心部分[19]，α-SMA是肝星状细胞的活化标志，这两种蛋白表达水平与肝纤维化程度密切相关。

本实验结果证明，CCl4皮下注射能够成功诱导兔肝纤维化模型，同时较其他造模方法具有简便、经济、可重复且造模成功率高等优点。血清生化指标方面，AST、ALT明显升高，并在造模过程中维持于较高水平，提示CCl4对肝细胞具有相对特异的毒性作用，持续的肝脏损伤进一步破坏了肝脏合成功能，导致ALB合成减少，但肝脏储备功能仍保持相对稳定水平，所以PALB、TP等未见明显降低；肝脏形态学方面，多普勒血管超声显示实验组门静脉血流速度较对照组明显减慢，提示肝脏血流阻力增大；12周时实验组兔肝脏HE及Masson染色均可见明显肝细胞坏死及空泡样脂肪变性，伴桥接样纤维间隔形成，部分假小叶形成，考虑在肝纤维化形成同时CCl4破坏细胞线粒体及内质网膜稳定性，肝细胞能量代谢障碍影响脂蛋白合成及脂质排出，导致肝细胞脂肪变性；免疫组化结果显示实验组12周时α-sma及Col-Ⅰ表达明显增强，且以纤维间隔及汇管区部分尤为明显，提示HSC大量活化成为具有促纤维化功能的肌成纤维样细胞表型，极大促进了肝纤维化的发展。螺旋CT扫描可见肝脏实质密度降低，结合组织病理结果提示肝脏在纤维化的同时发生了脂肪变性，这也是CCl4法诱导兔肝纤维化模型的弊端之一。CCl4为剧毒药物，剂量控制不当可导致动物产生严重不良反应，因此传统造模组动物死亡率高，我们在总结传统造模组经验的基础上，从低剂量开始给予动物一定的适应期，同时根据不同动物对药物反应适时调整CCl4用量，可以显著降低动物严重不良反应的发生率，且8周以后虽然所有动物的注射剂量均提升至1 ml·kg-1以上，仍未见明显的药物过量反应。根据实验动物的状态调整CCl4的注射剂量，虽然可能会导致动物肝纤维化程度的不均一，但是这种剂量调节方式主要着眼于降低动物死亡率，一旦度过早期的适应阶段后动物对药物产生耐受，这时再根据实验要求来调整剂量便可以诱导出成功率高且符合实验要求的动物肝纤维化模型。

同时本实验中也暴露出一些问题，CCl4植物油溶液诱导肝纤维化常合并一定程度的脂肪变性，考虑与CCl4作用机制及剂量浓度有关；CCl4诱导早期肝纤维化存在自发逆转现象，一方面可通过改变造模时间满足不同的实验需求，但另一方面也使造模的不稳定性增加。

综上所述，本研究利用CCl4法成功诱导兔肝纤维化模型，并且通过对传统造模方案进行分阶段、多步骤、个体化的改良，在保证造模成功率的基础上最大程度地降低了动物死亡率，为以肝纤维化为基础的相关研究工作提供了可靠的动物模型诱导方案。

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Modification of liver fibrosis model of rabbit induced by carbon tetrachloride

HOU Hong-wei1，PAN Zheng1，2，CHEN Min1，XU Jia-jia3，LI Wei-min1，JI Zhen-ling1，2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofGeneralSurgery，ZhongdaHospital,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 3.DepartmentofPathology，ZhongdaHospital,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To increase experimental efficiency and animal model’s quality of fundamental research which based on liver fibrosis model of animal by modify the traditional process of carbon tetrachloride(CCl4) induced liver fibrosis of rabbit. Methods: 50 healthy male new Zealand rabbits were included in this research and divided into 2 batches on average. Rabbits in first batch(traditional batch) were separated into 2 groups: modeling group(n=21) and control group(n=4). Rabbits in modeling group were injected with 50% CCl4olive oil solution subcutaneously twice a week for 12 weeks in succession while control group were treated with the same amount of pure olive oil. Rabbits in modeling group received color Doppler ultrasound， spiral computed tomography and serum biochemical examination every 4 weeks from the beginning to 12 weeks， 7 rabbits(remanent were divided equally when rabbits died unexpected ) were sacrificed after blood drawing every 4 weeks to measure portal venous pressure(PVP) and obtained liver tissues for biopsy and immunohistochemical(IHC) staining as well as staging according the ISHAK grading system; Control group were treated with the same way with modeling group and sacrificed at 12 weeks. Modify disadvantages exposed during experiment of first batch and apply revised scheme to the second batch(modified batch). Results: Mortality of traditional patch was 42.9% and significantly higher than modified batch of 9.5%(P<0.05) and the success rate of traditional patch(57.1%) was obviously lower than that of modified batch(85.7%)，too. With progression of modeling process，ALT， AST， ALB， TP of modeling group underwent significant changes compare to control group(P<0.05); color doppler flow imaging showed the speed of portal venous blood flow of modeling group was obviously slower and CT values were significantly reduced comparing to control group; HE， Masson and IHC staining showed explicit liver fibrosis and pseudolobule could be seen， ISHAK score rised over time(1.33±0.52，1.83±0.75，4.17±0.75 of modified modeling group at 4，8，12 week respectively). Conclusion: Continuous injection of CCl4 can induce explicit liver fibrosis of rabbit. By adjust modeling process of modeling process we can reduce mortality of animals drastically and guarantee the success rate at the same time and provide useful information for research based on liver fibrosis animal models.

liver fibrosis; liver cirrhosis; rabbits; animal models; carbon tetrachloride

2015-02-09

2015-03-19

江苏省科研基金资助项目(H201230)

侯洪伟(1989-)，男，江苏连云港人，在读硕士研究生。E-mail:767714726@qq.com

嵇振岭 E-mail:zlji@me.com

侯洪伟,潘峥,陈敏,等.四氯化碳诱导兔肝纤维化模型的改良[J].东南大学学报:医学版,2015,34(4):562-567.

R575.2; R-332

A

1671-6264(2015)04-0562-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．014