CXCR4基因转染间充质干细胞防治椎间盘退变的疗效观察

韦继南，蔡峰，吴小涛，王锋，洪鑫，王运涛，汤文浩

(1.东南大学 附属中大医院，江苏 南京 210009； 2.东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

·论 著·

CXCR4基因转染间充质干细胞防治椎间盘退变的疗效观察

韦继南1，2，蔡峰2，吴小涛1，王锋2，洪鑫1，王运涛1，汤文浩1

(1.东南大学 附属中大医院，江苏 南京 210009； 2.东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

目的:初步探讨高表达CXCR4的间充质干细胞防治椎间盘退变的疗效。方法:通过慢病毒载体转染系统将CXCR4基因转染间充质干细胞，使后者过表达CXCR4。将15只新西兰大白兔椎间盘穿刺制造退变模型后随即行细胞移植治疗，实验分为CXCR4-MSCs、MSCs和PBS组(对照组)，每组5只，术后4、8周从椎间盘高度、组织学、2型胶原mRNA及Aggrecan mRNA含量改变方面观察其疗效并进行分析。结果:基因转染后Western blot证实干细胞高表达CXCR4，转染成功。移植术后4周3组的椎间盘高度均较移植前明显下降，证实造模成功，3组之间差异无统计学意义；术后8周CXCR4-MSCs组椎间盘高度降低不明显，而MSCs组及PBS组显著降低，PBS组更为显著，差异有统计学意义。移植后4、8周，组织学可见CXCR4-MSCs组和MSCs组椎间盘退变显著减慢，表现出一定的延缓退变作用。RT-PCR结果表明，术后8周Aggrecan mRNA及2型胶原mRNA均有表达，其中CXCR4-MSCs组较MSCs组和PBS组Aggrecan mRNA表达明显增多，差异具有统计学意义；3组间2型胶原mRNA表达差异无统计学意义。结论:CXCR4基因转染成功，CXCR4-MSCs能明显延缓椎间盘退变。

间充质干细胞； 趋化因子受体4； 椎间盘； 治疗； 兔

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其具有多向分化能力近年来逐渐成为治疗椎间盘退变的种子细胞[1]，但干细胞体内移植后存活时间短，修复作用有限一直是学者不可回避的问题。因此，有必要进一步研究以提高干细胞修复椎间盘的效率。实验研究表明，退变椎间盘内有较高的基质细胞衍生因子-1(SDF-1)表达[2]。基质细胞衍生因子-1/趋化因子受体4(SDF-1/CXCR4)信号轴是调控BMSCs 向损伤、缺氧部位迁移的主要信号途径，提高CXCR4的表达能增强BMSCs迁移能力[3-5]。研究证实，退变的椎间盘内存在严重的缺血缺氧环境[6]。本实验通过基因转染使MSCs高表达CXCR4，提高其修复椎间盘退变的效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

低糖培养基(LG-DMEM，Gibco 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰酶(Sigma公司)，CXCR4 抗体(PL laboratories 公司)，CXCR4和α-Tublin一抗及相应二抗抗体、荧光二抗(均购自Abcam公司)，荧光显微镜(OLYMPUS公司)，3.0T磁共振(SIEMES公司)，新西兰大白兔(江苏省农业科学院)。

1.2 方法

1.2.1体外分离培养MSCs 无菌条件下获取2周龄新西兰大白兔股骨及胫骨髓腔冲洗液，贴壁培养法获得骨髓MSCs。加入LG-DMEM+10%胎牛血清，置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。细胞长至90%，0.25%胰蛋白酶消化传代。收集MSCs，流式细胞仪检测CD34、CD90、CD44和CD45的表达并用于后续实验。

1.2.2CXCR4慢病毒表达载体的转染及MSCs CXCR4蛋白的检测 应用本实验室成功构建并验证的CXCR4-pIRES2-EGFP重组质粒，通过慢病毒将CXCR4基因(带eGFP)转染至MSCs，荧光显微镜下观察转染细胞发出荧光情况。Western blot法检测MSCs中CXCR4蛋白：将收集的细胞裂解，调整蛋白终浓度为2 g·L-1，取20μg上样进行SDS-PAGE电泳并转移到PVDF膜上，分别加CXCR4和α-Tublin一抗及相应二抗，ECL显色后进行显影，分析CXCR4蛋白和α-Tublin的灰度值，以二者比值表示CXCR4蛋白的表达量。

1.2.3CXCR4-MSCs移植治疗椎间盘退变 选择南京农科院实验专用成年新西兰大白兔15只，平均体质量4.5 kg，雌雄不限，随机分3组，每组5只。1%戊巴比妥钠静脉麻醉后将新西兰大白兔左侧卧位固定，于棘突旁3cm由髂脊向上做纵行切口，腹膜后入路暴露L3/4、L4/5、L5/6椎间盘，用21G针头穿刺椎间盘取出髓核，A组(对照组)注入20μl PBS；B组(MSCs组)注入20μl含106个 MSCs的 PBS；C组(CXCR4-MSCs组)注入20μl含106个CXCR4-MSCs的PBS，压迫片刻，冲洗，分层缝合关闭切口，术后分笼饲养，不限制饮食。

1.3 疗效分析

1.3.1椎间盘高度 于术前、术后4、8周行腰椎摄片，在PACS工作站测量椎体及椎间隙高度。计算椎间盘高度指数(DHI)方法同蔡峰的研究[7]。

1.3.2组织学观察 移植术后4周及8周每组处死1只兔子，取出3个实验椎间盘，然后用4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙，石蜡包埋切片。每个椎间盘组织做5张不同层面切片，HE染色观察椎间盘退变情况。

1.3.3逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测椎间盘Ⅱ型胶原和Aggrecan基因表达 术后8周处死每组剩余的3只兔子，提取椎间盘组织，RT-PCR检测Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA表达。Ⅱ型胶原基因引物序列：上游引物5′-GTCTCCATAGCTGAAGTGB-3′，下游引物5′-CCATGCAGTACATGCGGG-3′。Aggrecan基因引物序列：上游引物5′-GCTACGGAGACAAGGATGAGT-3′，下游引物5′-CGTAAAAGACCTCACCCTCCAT-3′。反应体系条件如下：第1步：95℃，5 min，1个循环。第2步：95℃，30 s；56℃，30 s；72℃30 s；40个循环。第3步：72℃，2 min，1个循环。

1.4 统计学处理

所得数据以均数±标准差表示。应用SPSS 17.0统计软件分析，多个样本均数比较用单因素方差分析(One way ANOVA)，两两比较用 Dunnett法。假设检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 兔MSCs鉴定

获取的MSCs呈成纤维细胞形态，纺锤形或梭形。流式细胞结果显示：CD44表达率为(93.6±1.9)%、CD90为(96.1±2.7)%、CD45为(1.99±0.6)%、CD34为(1.3±0.4)%，证实贴壁分离培养的细胞是MSCs，CXCR4基因转染后的骨髓MSCs 发出明显的绿色荧光。见图1。

a.分离培养的MSCs，倒置相差显微镜下可见细胞呈长梭形，胞浆丰富； b.病毒转染CXCR4后的MSCs，可见细胞充满绿色荧光

图1 分离培养的MSCs(倒置相差显微镜)及CXCR4转染后MSCs(荧光显微镜)照片Fig 1 Cultured MSCs under inverted phase contrast microscope and CXCR-4 transfected MSCs under fluorescence microscope

2.2 MSCs CXCR4基因表达情况

Western blot结果显示，未转染组及空白载体(lenti)转染的MSCs组的CXCR4表达量极少，而CXCR4转染组内CXCR4表达量是前二者的数倍，显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 MSCs CXCR4表达情况

Fig 2 The expression of CXCR4 in MSCs

2.3 椎间盘高度

术后4周3个组的椎间隙高度均较术前(0周)明显下降，差异具有统计学意义，但3组之间差异无统计学意义。术后8周PBS组椎间隙高度进一步下降，与4周相比差异有统计学意义；而MSCs组椎间隙高度缓慢降低，CXCR4-MSCs组椎间隙高度与4周相比变化不大，与MSCs组8周相比明显恢复，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 DHI变化情况

Fig 3 DHI of three groups

2.4 组织学结果

2.4.1术后4周 PBS组：椎间盘髓核严重退变，基质黏液样改变，髓核结构松散，失去正常形态，细胞及基质排列紊乱，纤维环部分排列不规整，发生黏液变性，胶原纤维轻度肿胀，少部分出现裂隙及断裂。MSCs组：髓核基质退变较PBS组明显减轻，纤维环退变较轻，髓核与纤维环轻度分离，二者排列均较为整齐。CXCR4-MSCs组：髓核皱缩、变性，但髓核结构尚完整，基质退变较MSCs组轻，纤维环排列整齐，髓核与纤维环间出现较大的裂隙。见图4a、b、c。

2.4.2术后8周 PBS组：髓核萎缩、皱缩伴明显纤维化，部分被纤维组织代替，纤维环结构松弛、稀疏，出现裂隙。MSCs组：髓核及纤维环结构尚完整，未见明显裂隙，髓核轻度皱缩，逐渐恢复同心圆排列，纤维环胶原纤维肿胀，部分胶原纤维坏死。CXCR4-MSCs组：髓核基质一定程度得到再生，基质含量相对较丰富，髓核表现为轻度皱缩、退变，胶原含量显著增多、丰满；纤维环排列尚整齐，部分出现小的裂隙。见图4d、e、f。

图4 术后4周(a为PBS组，b为MSCs组，c为CXCR4-MSCs组)和术后8周(d为PBS组，e为MSCs组，f为CXCR4-MSCs组)椎间盘组织切片HE染色结果

Fig 4 Histological images of the Intervertebral disc at 4，8 weeks post-operation (Hematoxylineosin staining ×20)

2.5 Ⅱ型胶原及Aggrecan mRNA表达情况

细胞移植术后8周，RT-PCR结果显示，Aggrecan mRNA相对表达水平CXCR4-MSCs组0.92±0.06，MSCs组0.78±0.07，明显高于PBS组的0.64±0.12，差异有统计学意义(P<0.05)。3组椎间盘组织均表达Ⅱ型胶原及Aggrecan mRNA。CXCR4-MSCs组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量为0.74±0.11，3组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5 术后8周各组Aggrecan mRNA和Ⅱ型胶原mRNA相对表达量

Fig 5 The expression of Aggrecan mRNA and Col-2 mRNA in each group at 8 weeks post-operation

3 讨 论

椎间盘退行性变是骨科的常见病和多发病。目前针对椎间盘疾病的治疗除了保守治疗外，手术治疗主要包括椎间盘摘除、椎间植骨融合术，手术虽然在临床上取得了较为满意的疗效，但即使微创手术仍有一定的失败率[8]，况且手术治疗并不能保留椎间盘的功能，亦不能逆转椎间盘的退变，相反减少了椎体间的活动度，并增加了邻近椎间盘的活动度和压力，一定程度上加速了邻近椎间盘的退变[9]。

近年来随着细胞生物学和组织工程学的不断发展，退变椎间盘的生物学治疗逐渐成为研究热点[10]。而骨髓MSCs是目前椎间盘组织工程学干细胞研究最多、最热门的种子细胞，既往许多动物实验研究显示，利用自体骨髓MSCs来延缓退变椎间盘的进一步发展或治疗已经退变的椎间盘都获得了满意的效果。Sakai等首先将兔自体骨髓MSCs置于胶原凝胶支架培养后再植入兔椎间盘髓核中，结果显示其可减缓椎间盘退变，并于术后24周发现骨髓MSCs可移行至内层纤维环产生类似于髓核细胞分泌的基质成分[11]。显然，长达24周的“归巢”时间似乎难以实现对早期退变椎间盘的及时修复。此外，间充质来源细胞对附着环境中胶原等成分的特殊依赖[12]，也同样要求移植的MSCs能迅速迁移分散，充分与蛋白聚糖、胶原等基质大分子接触，才最利于MSCs自身的生存、增殖和发挥效应。因此，有必要进一步研究提高干细胞修复椎间盘的效率。

近年来，利用SDF-1/CXCR4信号轴促进MSCs归巢已显示出在提高MSCs修复效率方面的有效性和可行性[4，13-14]。MSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞群，但体外培养的MSCs只有很少一部分表达CXCR4[15]。Arimitsu研究表明，SDF-lα/CXCR4轴与细胞迁移关系密切，能够促进高表达CXCR4的细胞向高浓度SDF-lα区域迁移[16]。我们既往的研究表明，越靠近髓核中心区域组织退变越重，其免疫组化结果显示SDF-1含量越高[2]。因此，本研究通过慢病毒转染MSCs使其高表达CXCR4，再将高表达CXCR4的MSCs移植椎间盘，观察其延缓椎间盘退变的效果。结果表明，术后4周CXCR4-MSCs在组织学上已经表现出一定程度的延缓椎间盘退变；术后8周CXCR4组椎间盘高度逐渐恢复，椎间盘内蛋白含量增高，相对MSCs组及PBS组差异有统计学意义，逐渐展示其修复椎间盘的功能。Zhao等指出，BMSCs迁移能力的提高必将从修复范围角度促进其营养、分化及免疫调节效应的发挥，同时可以避免移植后因局部的大量细胞堆积而加重营养匮乏而恶化退变[17]。本研究中干细胞有可能通过该机制延缓椎间盘退变。然而，干细胞移植进入椎间盘体内后仍有诸多问题未得到回答。其一，其防治椎间盘退变的机制仍未清楚。有研究表明，其机制可能是干细胞本身分化为有功能细胞(如类髓核细胞)或者分泌生长因子或通过信号传导而间接支持宿主细胞再生。其二，干细胞在椎间盘内的命运和转归不清楚。干细胞移植入椎间盘后，大量细胞堆积造成局部营养匮乏，大部分迅速死亡，残余部分起再生作用。那么，这部分细胞如何发挥作用，是原地发挥作用抑或迁移，又该如何观察其命运转归，仍然有待进一步研究探索。

本研究初步结果显示了CXCR4基因转染后增强了MSCs对椎间盘的修复能力，其再生机制及体内迁移值得进一步的研究探索。

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Efficacy of CXCR4 over-expressed mesenchymal stem cells in the treatment of intervertebral disc degeneration

WEI Ji-nan1，2，CAI Feng2，WU Xiao-tao1，WANG Feng2，HONG Xin1，WANG Yun-tao1，TANG Wen-hao1

(1.ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To explore the role of high expression of CXCR4 mesenchymal stem cells(MSCs) during degeneration of intervertebral disc. Methods: Recombinant lentiviral vector transduction was carried out to over-express CXCR4 in MSCs. Cell transplantations were followed immediately by puncturing to create degeneration model. 15 New Zealand white rabbits were divided into three groups:CXCR4-MSCs groups， MSCs groups and PBS groups. Disc height Index， histological section HE stain and mRNA of Aggrecan and type Ⅱ collagen were obtained at 4 and 8 weeks after transplantations. Results: MSCs were efficiently over-expressed CXCR4 and verified by Western blot. 4 weeks after transplantations， the disc height of three groups decreased significantly than pre-operation. There were no significant differences among the three groups. There was no obvious decrease of disc height in CXCR4-MSCs group at 8 weeks after transplantations. But there were significantly decreases in MSCs groups and PBS groups. There were significant differences among three groups at 8 weeks. Disc degenerations in histology significantly slowed down in CXCR4-MSCs group and MSCs group at 4 and 8 weeks after transplantations rather than PBS group. RT-PCR results showed that Aggrecan mRNA and type Ⅱ collagen mRNA were both expressed at 8 weeks after transplantations. Aggrecan mRNA expression of CXCR4-MSCs group was more than that of MSCs group and PBS group， respectively, there was significant difference. Type Ⅱ collagen mRNA expressions of three groups had no significant differences. Conclusion: CXCR4 gene can be successfully transfected to MSCs. CXCR4-MSCs transplantation can significantly slow down intervertebral disc degeneration．

mesenchymal stem cells; CXCR4; intervertebral disc; treatment； rabbits

2015-02-21

2015-03-21

国家自然科学基金资助项目(81071493、81272035、81201423)；中央高校基本科研业务费专项资金资助；江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目(KYLX_0202)

韦继南(1980-)，男，广西玉林人，主治医师，在读博士研究生。E-mail：jinanwei@163.com

吴小涛 E-mail:wuxiaotao@medmail.com.cn

韦继南，蔡峰，吴小涛，等.CXCR4基因转染间充质干细胞防治椎间盘退变的疗效观察[J].东南大学学报:医学版，2015，34(4):541-546.

R681.53； R329.2

A

1671-6264(2015)04-0541-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．010