凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)对肺癌细胞增殖迁移的影响

刘万，郑倩倩，华子春，张晶

(南京大学生命科学院 医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093)

·论 著·

凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)对肺癌细胞增殖迁移的影响

刘万，郑倩倩，华子春，张晶

(南京大学生命科学院 医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093)

目的:近来凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)作为新的抗肿瘤治疗靶点受到关注，为了探讨c-FLIP(L)在肺癌细胞迁移中的作用，我们建立了c-FLIP(L)高表达稳定细胞株，以比较c-FLIP(L)在肺癌细胞株中表达水平与其细胞迁移能力的关系。方法：采用非小细胞肺癌A549细胞株进行转染c-FLIP(L)真核表达质粒，通过G418筛选出多株c-FLIP(L)高表达单克隆，以此为平台研究c-FLIP(L)在肿瘤细胞迁移过程中的作用。通过实时荧光定量QPCR及Western Blot检测稳定株中c-FLIP(L)表达水平；划痕实验及Transwell法检测c-FLIP(L)高表达对肺癌细胞迁移的影响，并通过荧光骨架蛋白染色观察细胞形态的改变。结果：QPCR和Western Blot显示A549稳定细胞株中c-FLIP(L)均为高表达；Wound healing和Transwell实验表明c-FLIP(L)高表达肺癌细胞迁移能力明显上升，并初步探索了c-FLIP(L)表达对细胞骨架的影响。结论：凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)的高表达能促进肺癌A549细胞的迁移。

肺癌； 凋亡抑制蛋白； c-FLIP(L)； 肿瘤迁移

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率占所有恶性肿瘤的第1位，女性肺癌发病率和死亡率占第2位[1]。肺癌细胞迁移是恶性肿瘤侵袭及转移的一个关键步骤，也是导致患者手术后复发和死亡的主要原因，目前针对肺癌转移的研究至今尚不完全明确。

c-FLIP(L)是一种重要的凋亡抑制蛋白，作为caspase-8结构同源类似物，通过自身的DEDs结构域竞争性结合凋亡接头蛋白FADD来抑制caspase-8的激活，发挥凋亡抑制作用[2]。近几年，相关文献报道了c-FLIP(L)除了抗凋亡功能外，还参与很多生理或病理过程并发挥多种重要作用，如促进细胞增殖、影响细胞坏死等[3-5]。肿瘤细胞的增殖失控、分化异常以及具有迁移和浸润能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，特别是肿瘤细胞的迁移和浸润对抗肿瘤治疗有十分重要的意义。目前发现几乎所有的肿瘤细胞中c-FLIP(L)的表达水平都升高，c-FLIP(L)已经成为抗肿瘤的靶点越来越被重视[6]。为此，我们建立了多株c-FLIP(L)高表达肺癌细胞株，以此为平台初步探讨c-FLIP(L)在肿瘤中迁移和浸润中的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

肺癌细胞A549由本实验室冻存，质粒pCDNA3.1和pCDNA3.1-FLIP均来自Dr.JK Zhang(Kimmel Cancer Center，USA)赠与，TRIzol购自Ambion公司，真核转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，Transwell小室购自Corning公司，DMEM培养基和胎牛血清购自Wisent公司，RNA逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自诺唯赞公司,抗体β-actin购自华安生物公司，抗体c-FLIP(L)购自Cell signaling，骨架染料Texas Red-X phalloidin(T7471)购自invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1细胞转染以及单克隆稳定株的筛选 人肺癌细胞A549培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于体积分数为5% CO2细胞箱中37 ℃培养。当细胞培养到贴壁密度达到70%～80%时对细胞进行转染，设为对照组(转染pCDNA3.1空载质粒)和实验组(转染pCDNA3.1-FLIP质粒)，按照转染说明书进行。转染24 h后加入G418(800 mg·L-1)筛选，约2周左右获得多克隆稳定株进行96孔板稀释，继续培养获得阳性单克隆，再用含200 mg·L-1G418的培养液扩大培养，获得稳定表达FLIP的单克隆稳定株，冻存。

1.2.2实时荧光定量PCR(QPCR) 获取A549细胞提取总RNA，根据RT试剂盒说明书逆转录合成cDNA。取上述cDNA作为模板进行PCR扩增，引物序列如下：GAPDH：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′(Forward)和5′-GCAGGAGGCATTGCTGAT-3′(Reverse)；c-FLIP(L):5′-AATTCAAGGCCAGAAGCGA-3′(Forward)和5′-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3′(Reverse)。RT-PCR反应条件为：高温变性阶段(95 ℃，10 min)；循环扩增阶段(95 ℃，15 s；60 ℃，1 min)共40个循环；溶解曲线阶段(95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s)。采用1.5%的琼脂凝胶电泳验证扩增的特异性。QPCR仪器购自AB公司，根据说明书操作，每个样品设3个重复，结果用2-△△Ct法计算。

1.2.3Western Blot分析 收集细胞用预冷PBS洗涤两次，加入RIPA液(碧云天，编号P0013)进行裂解细胞，冰上放置20 min后12 000 r·min-1离心10 min，收集上清。考染法进行蛋白质定量后加入4×loading buffer混匀，煮沸5 min。采用10%浓度SDS-PAGE凝胶，取适量上述样品点样，接通电源，按照堆积胶80 V、分离胶120 V恒压电泳。待电泳完毕进行湿转，4 ℃下300 mA恒流电转1.5 h。转膜结束，5%脱脂奶粉液室温下封闭1 h，然后包被一抗溶液4 ℃过夜。次日PBST洗膜4次，每次5 min，包被二抗溶液室温1 h，PBST洗涤后滴加增强化学发光底物反应液孵育2 min，采用蛋白分析仪器拍摄后进行结果分析[7]。

1.2.4Transwell细胞迁移实验 待细胞生长至贴壁80%时PBS洗2遍，用无血清培养液将细胞饥饿过夜。次日胰酶消化细胞，加完全培养液终止胰酶作用，离心去除后加入无血清培养液重悬，细胞计数调整密度至1×106ml-1，取100 μl细胞悬液加入Transwll板的上室，下室加入800 μl含10%胎牛血清的DMEM培养液诱导细胞迁移，37 ℃常规培养4 h。用棉签轻轻擦去上室内未穿膜的细胞，PBS洗3次，用4%的多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色20 min后用荧光显微镜(×400)拍摄观察穿膜的细胞。使用33% HAc 100 μl吹洗小室，至完全溶解结晶紫后进行酶标仪570 nm定量分析。

1.2.5Wound healing实验 A549细胞接种24孔板长满后用200 μl移液器枪头在培养板底部划“一”字形划痕，PBS漂洗贴壁细胞，弃去漂浮细胞后加入培养液继续培养，并于此后0、24 h在倒置显微镜下观察细胞划痕相对宽度并拍照，多个视野进行记录。

2 结 果

2.1 c-FLIP(L)稳定细胞株的鉴定

A549肺癌细胞中转染pcDNA3.1-FLIP表达载体后，经过96孔板稀释及G418筛选获得数个具有G418抗性的A549细胞单克隆株，其中两株编号为克隆1#和克隆2#，与对照组转染pcDNA3.1进行表达验证。QPCR结果显示，单克隆株克隆1#和克隆2#中c-FLIP(L)mRNA表达水平较对照组明显上升(图1)。进一步采用Western Blot检测c-FLIP(L)蛋白质水平，结果与QPCR一致，稳定株克隆1#和克隆2#中c-FLIP(L)蛋白水平也明显增加(图2)，说明我们成功获得了c-FLIP(L)高表达的A549稳定细胞株。

con表示对照组，1#和2#为c-FLIP(L)单克隆株

图1 定量PCR验证c-FLIP(L) mRNA表达水平

Fig 1 The expression of c-FLIP(L) mRNA detected by QPCR

con为对照组，1#和2#为c-FLIP(L)单克隆株

图2 蛋白印迹法验证c-FLIP(L)蛋白表达水平

Fig 2 The protein expression of c-FLIP(L) detected by Western Blot

2.2 c-FLIP(L)高表达对A549细胞迁移能力的影响

为了探讨c-FLIP(L)对肿瘤迁移的影响，我们分别进行了划痕实验和Transwell实验，比较c-FLIP(L)高表达株与野生型对照株之间的差异。结果如图3A显示，c-FLIP(L)高表达能够促进肿瘤细胞的迁移数量显著增加，经醋酸溶解结晶紫后酶标仪定量检测结果如图3B，随着c-FLIP(L)表达量增加(2#>1#>con，图1、2)，肿瘤细胞的迁移量也增加，呈正相关性。在划痕实验中检测肺癌细胞迁移能力的变化，与对照株相比，c-FLIP(L)稳定表达株也表现为迁移能力明显增强(图4)。这些结果提示，c-FLIP(L)具有促进肺癌细胞迁移的作用。

2.3 c-FLIP(L)表达对细胞骨架结构的影响

癌细胞的活跃运动能力主要来自于肌动蛋白等骨架蛋白的状态，骨架的变化不仅在细胞恶性转化中发挥重要作用，还为衡量恶性肿瘤细胞生物学行为提供结构性标志[8]。采用鬼笔环肽(Texas Red-X)荧光染料进行细胞微丝特异性染色，如图5结果显示：对照细胞内微丝骨架比较完整，有正常微丝束的形成，而c-FLIP(L)稳定细胞株胞内微丝的完善程度差，弥散不能呈束状，但细胞边缘伪足状态明显，提示了c-FLIP(L)表达可能导致微丝骨架组装的改变与肿瘤迁移能力相关。

3 讨 论

肺癌是世界范围内最常见高发的恶性肿瘤之一，其前期诊断困难，扩散快，一旦确诊大部分已转移丧失治疗机会，而放疗和化疗一直无重大突破，所以迫切需要寻找新的治疗手段和治疗靶点。据统计90%肿瘤患者的死亡由肿瘤转移引起，是肿瘤患者临床致死的主要原因，所以针对肿瘤转移的研究工作显得非常重要。

随着肿瘤治疗研究的深入，c-FLIP(L)作为重要的靶蛋白越来越被重视，除了c-FLIP(L)抗凋亡功能直接与肿瘤治疗相关以外，c-FLIP(L)还参与细胞增殖，激活NF-κB、ERK/AP-1及β-catenin等途径，为细胞生存提供多重保护[9-10]。有研究表明，恶性程度越高的肿瘤细胞中c-FLIP(L)的表达量越大，以黑色素瘤为例，c-FLIP(L)在高转移黑色素瘤细胞株B16F10中的表达明显高于低转移性黑色素瘤细胞B16F1，这意味着c-FLIP(L)的表达对肿瘤转移可能有促进作用。为了研究c-FLIP(L)与肿瘤迁移相关性，我们先筛选建立了c-FLIP(L)稳定表达株，在此基础上确认了c-FLIP(L)的表达参与并促进肿瘤细胞迁移，并初步探索了可能的原因，为后期深入进行分子机制研究提供了良好的平台。

a.A549对照株和稳定株用无血清饥饿过夜，次日胰酶消化后计数，接种相同数量细胞(1×105个)加入内室(无血清培养液)，外室采用10%胎牛血清完全培养液进行诱导，4 h后拍照; B.上述样品用醋酸溶解结晶紫后检测OD570 nm的吸收值

图3 Transwell实验显示c-FLIP(L)稳定株迁移能力显著增强

Fig 3 c-FLIP(L) enhanced cell migration determined by Transwell assay

A549稳定株和对照株接种于24孔板，待其长满后进行刮痕，洗涤脱落细胞后加入完全培养液继续培养24 h，分别于0、24 h拍照

图4 划痕实验证明c-FLIP(L)表达明显促进“伤口愈合”

Fig 4 c-FLIP(L) promoted cell migration detected by wound healing assay

采用鬼笔环肽对细胞骨架微丝染色，DAPI对细胞核染色

图5 c-FLIP表达影响细胞微丝骨架结构

Fig 5 The cytoskeleton by Texas Red-X staining in A549 cells

本研究中，我们获得了多株c-FLIP(L)不同程度的高表达肺癌细胞稳定株，通过划痕实验和Transwell实验分别验证了c-FLIP(L)的表达水平与肿瘤细胞的迁移密切相关，并呈正相关，随着c-FLIP(L)表达量的增加，A549细胞的迁移能力明显增强，这一结果有力地说明c-FLIP(L)确实参与肿瘤细胞迁移过程，但其作用机制尚不清楚。我们初步考察了与肿瘤迁移密切相关的细胞骨架是否发生改变，因为微丝骨架的组装完善程度与肿瘤的转移能力呈负相关，在肿瘤细胞转移中发挥重要作用。通过荧光染色比较A549对照株与稳定转染株的骨架差异，可以明显看出c-FLIP(L)稳定表达株胞内微丝束消失，表现为弥散状，结构遭破坏，而细胞边缘伪足状微丝增加，有利于细胞迁移。骨架的异常改变为肿瘤迁移提供基础，c-FLIP(L)是否通过改变骨架结构促使肿瘤细胞获得迁移能力？后期我们将围绕这一可能进一步开展研究。全面了解c-FLIP(L)在肿瘤迁移中的作用及其机制，加深对肿瘤迁移机制的探索，在为临床防治肿瘤转移提供新的思路和方法上具有重要意义。

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The effect of cellular FLICE-like inhibitory protein(c-FLIP(L))on cell migration in lung cancer cell

LIU Wan，ZHENG Qian-qian，HUA Zi-chun，ZHANG Jing

(StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology，CollegeofLifeSciences，NanjingUniversity，Nanjing210093，China)

Objective： Cellular FLICE-like inhibitory protein (c-FLIP(L)) is an important target for cancer therapy. In this study， we established stable cell line in A549 overexpressing c-FLIP(L) and to examine the potential role of c-FLIP(L) in migration of lung cancer cells. Methods: A549 cells was transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1-FLIP and then selected with G418. Expressions of c-FLIP(L) in stable cells were detected by QPCR and Western Blot. The effect of c-FLIP(L) on cell migration was determined using Would healing and Transwell assays， respectively. Results： c-FLIP(L) was successfully highly expressed in A549 stable cells， and increased expression of c-FLIP(L) significantly promoted cell migration testified by Wound healing and Transwell assay. Conclusion: c-FLIP(L) is upregualted in A549 cells relative to the migration ability. This finding is helpful for exploring the molecular mechanism of metastasis in lung cancer cells．

lung cancer; inhibitor of apoptosis protein; cellular FLICE-like; tumor migration

2015-03-09

2015-04-08

国家自然科学基金资助项目(31071196)

刘万(1992-)，男，安徽安庆人，在读硕士研究生。E-mail:1019034894@qq.com

张晶 E-mail:jzhang08@nju.edu.cn

刘万,郑倩倩,华子春,等.凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)对肺癌细胞增殖迁移的影响[J].东南大学学报:医学版,2015,34(4):536-540.

R734.2； R318

A

1671-6264(2015)04-0536-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．009