PHBV纳米纤维对大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的形态学影响

沈旭,蒋赞利,吴小涛,张晓峰,谢鑫荟,肖倩茹,黄宁平,王野

(1.东南大学医学院,江苏南京 210009； 2.东南大学生物科学与医学工程学院，生物电子学国家重点实验室，江苏 南京 210009)

·论 著·

PHBV纳米纤维对大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的形态学影响

沈旭1,蒋赞利1,吴小涛1,张晓峰2,谢鑫荟1,肖倩茹2,黄宁平2,王野1

(1.东南大学医学院,江苏南京 210009； 2.东南大学生物科学与医学工程学院，生物电子学国家重点实验室，江苏 南京 210009)

目的：探究聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)纳米材料对大鼠间充质细胞向神经干细胞分化的影响，为PHBV纳米材料与骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合移植治疗脊髓损伤提供新的依据。方法：采用贴壁分离培养的方法分离纯化大鼠BMSC，传至3～4代后接种至PHBV纳米纤维膜(定向与非定向)上，以接种至玻片上为对照组，倒置显微镜下观察对照组细胞形态，待细胞与PHBV纳米纤维膜融合(24 h)后，以维甲酸(RA)作为增殖及分化诱导因子对BMSCs进行增殖培养、分化诱导，1周后，实验组采用4%多聚甲醛固定，应用电镜观察细胞形态，用Nestin抗体免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞。结果：BMSCs与PHBV纳米纤维膜有很好的相容性，加入RA诱导剂72 h 后细胞形态开始变化，胞体开始回缩，突起逐渐伸出。电镜观察下定向PHBV组的神经元样细胞被显著拉长，并且细胞沿定向纤维的方向伸展，非定向PHBV组与对照组的神经细胞则无明显的拉长状态。免疫荧光染色验证均有Nestin阳性细胞表达。结论：定向纳米纤维通过引导细胞骨架延伸从而对细胞形貌产生显著影响。与非定向纳米纤维相比，神经元样细胞在定向纳米纤维表面被显著拉长。因此，我们认为定向纳米纤维支架可能在神经组织工程中更有优势。

骨髓间充质干细胞； 聚羟基丁酸戊酸共聚酯纳米材料； 神经干细胞; 大鼠

聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)是聚羟基丁酸和聚羟基戊酸的共聚物，它在生物体内主要作为细胞的碳源和能源的贮存物质，具有生物可降解性、生物相容性、压电性、光学活性、修复骨缺损等许多优良特性[1]。除生物活性支架外，组织工程中另一个重要的挑战就是种子细胞的选择。骨髓来源的间充质干细胞是一种成体干细胞,具有多向分化潜能[2]。研究表明，在没有化学和生物诱导成分条件下，骨髓间充质干细胞(BMSCs)在PHBV纳米纤维膜上可以分化为成骨细胞[3]、成脂细胞及神经细胞[4]。本实验就是对大鼠BMSCs在PHBV纳米纤维膜上分化为神经干细胞进行研究，以了解PHBV纳米纤维材料对细胞形态的影响，探讨它们作为神经组织工程载体材料的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4周SD雌性大鼠6只(江苏省实验动物中心提供)，静电纺丝制备定向与非定向PHBV纳米纤维材料膜(东南大学生物医学系仿生材料研究室提供),定向PHBV纤维直径为(383±143)nm，非定向PHBV纤维直径为(500±86)nm，孔径为100～150 μm，孔隙率93%(图1)。主要试剂: a-MEM培养液、DMEM低糖培养液、胎牛血清(hyclone)，维甲酸(RA)，兔抗巢蛋白(Nestin)。实验仪器: 扫描电子显微镜(德国FEI公司)，倒置荧光显微镜(尼康)，共聚焦显微镜(Andor， Northem Ireland)。

a.定向纳米纤维； b.非定向纳米纤维

图1 高压灭菌后PHBV静电纺丝纤维膜SEM照片

1.2 方法

1.2.1BMSCs的提取 将4周龄SD大鼠的胫骨和股骨分离出来，浸泡在75%的乙醇中，转入超净工作台内，用培养液洗去骨表面的乙醇，沿骨垢剪掉骨的两端，暴露出骨髓腔，用无菌注射器吸取10 ml细胞生长培养液(α-MEM，美国，添加10%的胎牛血清及1%的双抗，美国)冲洗骨髓腔，将骨髓冲出转移至25 cm2细胞培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下培养。提取后培养24 h首次换液，以后每3 d换液1次。约1周后悬浮细胞经换液大部分被除去，贴壁生长的即为BMSCs。10 d后BMSCs达到80%融合，去除培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞后0.25%的无EDTA的胰酶37 ℃消化5 min，然后加入3 ml 培养液终止消化。吹打均匀后，细胞悬液以1∶2 传代到新的细胞培养瓶中。

1.2.2PHBV纳米纤维的处理 无菌条件下将制备好的PHBV膜从塑封袋中取出，平铺于48孔板中，其中定向及非定向PHBV膜各占15孔，PHBV材料膜上用特质压环固定，防止材料上浮，对照组孔板中平铺玻片，每孔加200 μl培养基。接种前预浸泡24 h。

1.2.3BMSCs的接种 将BMSCs传至第3代，按1×104个·ml-1接种至48孔板中，每孔加200 μl细胞悬液置37 ℃培养箱中培养。待细胞与PHBV纳米纤维膜融合后将样品从培养板中取出，轻轻地用PBS洗3次，用2.5%的戊二醛室温下固定2 h，PBS洗1次后用梯度酒精脱水(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)各10 min。样品自然干燥，喷金后用SEM(Ultra plus，Zeiss，德国)观察细胞的形态。

1.2.4BMSCs的诱导及分化 其余各孔吸除培养基，加入RA诱导液200 μl置于37 ℃培养箱中，72 h后观察细胞形态变化，每隔3 d换1次液，至第6天时取出PHBV膜，多聚甲醛固定，使用电镜观察细胞在PHBV纤维膜上的生长形态。

1.2.5细胞免疫组化染色 取出的PHBV材料膜用PBS洗涤3次，每次3 min，4%甲醛PBS固定细胞, 3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶10 min，之后用山羊血清封闭。加入兔抗大鼠神经干细胞标记性蛋白Nestin(1∶100)特异性一抗，4 ℃湿盒孵育过夜，滴加试剂1。室温孵育20 min，PBS洗3次，滴加试剂2，室温孵育20 min，PBS洗3次，DAB溶液显色，纯水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片(具体方法参照美国GBI公司兔超敏二步法免疫组化试剂盒说明)。在免疫荧光显微镜下观察。

2 结 果

2.1 BMSCs的形态观察

原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，2 d后首次换液去除未贴壁细胞。3～4 d后细胞进入对数生长期，呈集落样生长，7 d左右可观察到贴壁细胞逐渐增多，细胞排列成漩涡状、网状、辐射状见图2。

2.2 BMSCs在PHBV纳米材料上的生长形态及黏附情况

电镜下可观察到细胞很好地黏附在PHBV纳米纤维膜上。在定向PHBV纳米纤维膜表面可以看到细胞沿纤维方向被拉长，还可以观察到丝状伪足沿着纤维的方向延伸，在非定向PHBV纳米纤维膜上生长的BMSCs向四周伸展，主要呈现出三角形或梭形形貌。而且我们发现，非定向PHBV纳米纤维膜相对于定向PHBV纳米纤维膜表现出更好的细胞相容性(图3、4)。

图2 BMSCs在玻片上生长增殖图

图3 BMSCs在定向PHBV纳米纤维膜上培养的SEM图

图4 BMSCs在非定向PHBV纳米纤维膜上培养的SEM图

2.3 诱导分化后细胞生长情况和形态变化及免疫荧光染色鉴定

传至第3代的BMSCs加入含有RA的神经干细胞诱导液，72 h后在倒置显微镜下即可见少量细胞胞体开始回缩，边缘变得不规整，突起逐渐伸出(图5)。6 d后取出PHBV纳米纤维膜，固定后置于电镜下观察，定向PHBV组的神经元样细胞被显著拉长，并且细胞沿定向纤维的方向伸展，非定向PHBV组与对照组的神经细胞则没有明显的拉长状态，且细胞的突起多于定向组(图6)。3组诱导6 d后均行Nestin抗体免疫细胞化学染色，可见3组均有Nestin抗体免疫阳性的表达，即神经干细胞的生成(图7)。

图5 BMSCs在玻片上诱导向神经细胞分化图

a.神经细胞在定向PHBV纳米纤维膜分化生长图； b.神经细胞在非定向PHBV纳米纤维膜分化生长图

图6 神经细胞在PHBV纳米纤维膜上生长的SEM图

a.定向PHBV； b.非定向PHBV； c.玻璃片

图7 RA诱导BMSCs在不同材料上向神经方向分化免疫荧光染色图

3 讨 论

研究显示BMSCs在体外培养、扩增后，诱导其向神经细胞方向分化并植入到受损的大鼠脊髓处，发现可促进大鼠的功能恢复，但是并没有使功能恢复达到理想的结果[5]。结合文献我们认为，虽然移植BMSCs可促进脊髓损伤的恢复，但是其植入的体内环境可能最终影响其分化，导致修复效果不理想[6-7]。我们设想为移植的BMSCs营造一个适合的三维环境，可促使其最大限度地发挥作用，我们猜想将BMSCs置入某种材料后植入脊髓损伤的区域，来观察其对脊髓损伤的修复。

近年来组织工程技术发展日新月异，PHBV因为其良好的降解性和生物相容性被制作成了不同类型的支架用于组织工程领域[8]。在众多支架材料中，通过静电纺丝技术制成纤维的直径分布可从数十纳米到几微米，可以很好地模拟细胞外基质，因此得到了越来越多的关注[9]。本实验中，定向及非定向的PHBV纳米纤维膜是通过静电纺丝的技术获得，制作过程中加入了PEO，提高了PHBV的可加工性，因此制成了直径均匀、连续性很好的纳米纤维膜[10]。除了支架，组织工程中另一重要因素便是种子细胞，通过实验观察可见BMSCs在PHBV纳米纤维膜表面黏附和增殖明显优于在玻璃片上，这是因为纳米纤维膜有着更高的孔隙率、表面粗糙度和比表面积，这些结构特性可以使纳米纤维能更好地和细胞黏附，促进细胞之间的通信、营养物质的交换以及新陈代谢作用[11]。Wei等[12]指出细胞在定向和非定向PHBV纳米纤维膜上的黏附及活性也有差异，与定向PHBV纳米纤维相比，非定向PHBV纳米纤维表现出更好的细胞相容性，更能促进细胞的增殖，这可能是由于非定向PHBV纳米纤维的表面空隙及粗糙程度比定向PHBV纳米纤维更大，更易于细胞的黏附。将BMSCs接种于不同取向的PHBV纳米纤维膜及载玻片上，待细胞与各组材料融合后，结合SEM观察我们发现，生长于PHBV纳米纤维膜表面时，细胞的丝状伪足沿纳米纤维的方向延展，且细胞形态与纤维的取向有关[4,13]。加入RA诱导剂后，分化生成的细胞形态也发生了显著变化。在定向PHBV纳米纤维膜表面的神经干细胞被显著拉长，并且突起沿定向纤维的方向伸展，非定向PHBV组神经干细胞则无明显的拉长状态，突起则沿着纤维向四周伸展。细胞生长于定向PHBV纳米纤维膜表面时，其长径比也有显著增加，Yang等[14]在纳米沟槽基底和定向纤维上培养细胞的研究也得到了相同的结论，可能由于基底材料的接触引导作用所致。因此，有特定排列的定向PHBV纳米纤维膜更能控制BMSCs分化的神经干细胞的形态，使细胞沿着一定的方向生长，这与神经再生定向生长的性质符合。本研究结果表明定向PHBV纳米纤维膜能引导细胞沿着一定方向生长，我们还需进一步利用RT-PCR检测定向及非定向PHBV纳米纤维膜对BMSCs分化率影响的差异，为PHBV材料和BMSCs联合移植治疗脊髓损伤提供体外依据。

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Morphological study on inducement and differentiation of nerve cells derived from rat BMSCs on PHBV

SHEN Xu1，JIANG Zan-li1，WU Xiao-tao1，ZHANG Xiao-feng1，XIE Xin-hui1，Xiao Qian-ru2，HUANG Ning-ping2，WANG Ye1

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.StateKeyLaboratoryofBioelectronics，SchoolofBiologicalScienceandMedicalEngineering，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To investigate the impact of PHBV nanomaterials on differentiation of bone marrow stromal cells (BMSCs)into neural stem cells，and to provide a new basis for the treatment of spinal cord injury with combined transplantation containing BMSCs and PHBV. Methods： BMSCs derived from rat bone marrow were used to investigate the effects of aligned(A-NF)and random—oriented(NF) PHBV nanomaterials on cell adhesion and differentiationinvitro， SEM was used to observe BMSCs. Results： After six days of adding in the RA medium，we can see cells extend along with the direction of orientation of the fibers. Neural stem cells were detected with immunostaining for Nestin.Conclusion： The A-NF PHBV has a significant effect on cell morphology by guiding the cytoskeleton extending，neural stem cells are significantly elongated on the surface of the A-NF PHBV compared with the NF PHBV.

bone marrow stromal cells; PHBV nanomaterials; neural stem cells; rats

2015-01-06

2015-03-18

沈旭(1988-)，男，安徽蚌埠人，在读硕士研究生。E-mail：shenxu233@126.com

蒋赞利 E-mail:jiangzanli@126.com

沈旭,蒋赞利,吴小涛,等.PHBV纳米纤维对大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的形态学影响[J].东南大学学报:医学版,2015,34(4):531-535.

R681.5; R329.2

A

1671-6264(2015)04-0531-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04.008