生长期和pH值对格氏链球菌自溶酶atlS基因表达的影响

刘敏 闫嘉惟 刘娅玲 郝玉庆

1.滨州医学院附属医院口腔内科，滨州 256603；2.口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院（四川大学），成都 610041；3.成都市第五人民医院口腔科，成都 610041

自溶酶是革兰阳性菌产生的一种细胞壁肽聚糖水解酶。目前，细菌自溶酶的作用与调控机制已成为致病性生物膜研究的热点之一，但对于有益菌自溶酶的研究甚少，而有益菌自溶酶对细菌生存竞争与生物膜生态平衡可能具有重要作用[1]。

口腔有益菌格氏链球菌（Streptococcus gordonii，S.gordonii）是菌斑生物膜最早期的定植菌之一，在健康菌斑中占有相当高的比例，对维护菌斑的生态平衡具有重要意义[2]。S.gordoniisg2013蛋白是形成正常细胞壁结构、生物膜及细菌自溶酶的关键蛋白。该蛋白能够水解S.gordonii细胞壁的肽聚糖，具有自溶酶功能，命名为AtlS[3]。研究[3]发现，AtlS对细菌生存竞争及拮抗致龋菌有重要作用。基于AtlS在S.gordonii生存竞争及拮抗致龋菌具有重要作用以及氧和pH值对细菌生长的影响，本实验运用荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）的方法研究S.gordonii的atlS基因在不同生长期及pH值的表达差异，进而分析调控S.gordoniiatlS表达的因素。

1 材料和方法

1.1 实验菌株和培养基

S.gordoniiATCC 35105购于美国标准品收藏中心。脑心浸液（brian heart infusion，BHI）培养基（Oxoid公司，英国）；两种TY（tryptone yeast）培养基，一种pH=7.0，由50 mmol·L-1磷酸钾缓冲液配制；另一种pH=5.5，由6 mol·L-1盐酸配制。

1.2 主要仪器及设备

YJ-875型超净工作台（苏州净化设备厂），7300型FQ-PCR仪（Applied Biosystems公司，美国），Hermle Z323K型低温离心机（Hermle Labartechnik公司，德国），SPΕCTRONIC 200型分光光度计（Thermo Fisher公司，美国），pH计（Mettler Toledo公司，瑞士），Bio-Rad电泳仪（Bio-Rad公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验菌株的培养 1）BHI培养基中实验菌株的培养。S.gordoniiATCC 35105于37 ℃下置于BHI琼脂培养基中复苏，兼性厌氧（80% N2、10% H2、10% CO2）条件下培养24 h后传代，接种于液体BHI培养基，37 ℃兼性厌氧培养12 h，备用。2）TY培养基中实验菌株的培养。S.gordoniiATCC 35105于37 ℃下置于BHI琼脂培养基中复苏，兼性厌氧培养24 h后分别接种于TY/pH7.0和TY/pH5.5培养基中传代，37 ℃兼性厌氧培养12 h，备用。

1.3.2S.gordonii生长曲线的测量 将S.gordonii培养物调整到相同的菌密度后，一式三份分别接种于含有50 mL BHI、TY/pH7.0和TY/pH5.5培养基的锥形瓶中，混匀菌液，在96孔板上分3组，每组3孔，每孔加菌液200 μL，培养24 h。用自动酶标仪每小时测量1次光密度（optical density，OD）值，重复3次，绘制24 h生长曲线，确定S.gordonii的生长期。

1.3.3S.gordonii样本收集 以BHI作为培养基，分别在S.gordonii对数生长早期、对数生长中期、对数生长晚期及生长稳定期收集细胞。将TY/pH7.0和TY/pH5.5培养基分别植入菌液后置于37 ℃有氧摇床（速度为150 r·min-1）上培养，收集S.gordonii生长稳定期细胞；其中TY/pH7.0培养基作为中性条件，TY/pH5.5培养基作为酸性条件。

1.3.4 FQ-PCR检测atlS基因mRNA表达水平S.gordonii收集完成后，采用FQ-PCR方法检测atlS基因在不同生长期（对数生长早、中、晚期和稳定期）和不同pH值（7.0和5.5）条件下mRNA的表达水平。1）RNA提取和cDNA合成。按Trizol总RNA抽提试剂说明书分别对不同生长期和不同pH值下收集的S.gordonii进行RNA提取，按照Fermentas逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，-20 ℃保存。2）引物设计。采用S.gordoniiATCC 35105的16S rRNA基因为内参。根据参考文献[4]中得到的S.gordoniiATCC 35105的atlS基因片段核苷酸序列，利用Primer5.0软件设计引物，序列如下。atlS基因引物，F：5’-CAGTCATAACGGAAGCATAAGC-3’，R：5’-CACTTGCAAACCAGCCAACTGG -3’，产物154 bp；16S rRNA内参[5]引物，F：5’-AAGCAACGCGAAGAACCTTA-3’，R：5’-GTCTCGCTAGAGTGCCCAAC-3’ ，产物195 bp。设计的引物在GenBank上用BLAST程序检测其特异性，结果显示与S.gordonii的atlS基因的匹配率最高。3）FQ-PCR扩增。采用TaKaRa公司的SYBR®Premix Εx TaqTMⅡ（Perfect Real Time）试剂盒，操作按说明书进行，反应体系总体积为20 μL。用RNase Freed H20将每个cDNA样本稀释5～10倍，置于7300型FQPCR仪上，进行PCR反应，每组的目的基因atlS与内参基因16S各设 3个平行管。读取各样本Ct值。4）琼脂糖电泳。取5 μL PCR扩增产物，加1 μL 6×Loading Buffer，在1.2%琼脂糖凝胶，1×TBΕ缓冲液中电泳35 mins，电压为100 V，电流为80 mA，采用Bio-Rad凝胶成像系统观察并记录。5）数据分析。atlS基因mRNA的相对表达量用2-ΔΔCt法计算。不同生长期和不同pH条件下的ΔCt计算公式如下：ΔCt=atlS基因Ct值-16S rRNA Ct值。对不同生长期的分析中，以对数生长早期为对照组；对不同pH条件下分析中，以TY/7.0为对照组。ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt对照组，计算得出atlS基因mRNA的相对表达量。使用SPSS 16.0统计软件进行分析，两组间的比较采用t检验，多组比较采用方差分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 S.gordonii的生长曲线

S.gordonii在BHI和TY/pH7.0、TY/pH5.5培养基中的生长曲线见图1、2：该细菌的对数生长早期为3 h，对数生长中期为4 h，对数生长晚期为5 h，稳定期为7 h；在中性和酸性条件下到达稳定期的时间分别为7 h和8 h。

图1 BHI培养基中S.gordonii的生长曲线Fig 1 The growth curve of S.gordonii in BHI culture medium

图2 TY培养基中S.gordonii的生长曲线Fig 2 The growth curve of S.gordonii in TY culture medium

2.2 atlS基因mRNA的相对表达量分析

atlS基因在不同生长期和pH值下的相对表达量见图3、4。经统计学检验，在不同生长时期atlS基因的相对表达量均有差异（P＜0.05），可以认为从对数生长早期到稳定期该基因的表达逐步升高；在中性和酸性条件下表达量的差异也有统计学意义（P＜0.05），中性条件下的表达量高于酸性条件下。

图3 S.gordonii在不同生长期atlS基因表达差异Fig 3 Differential expression of atlS gene of S.gordonii at different growth stages

图4 S.gordonii在不同pH值下atlS基因表达差异Fig 4 Differential expression of atlS gene of S.gordonii at different pH value

3 讨论

龋病是最常见的人类感染性疾病之一，属于生态失衡性疾病，其发生与菌斑生物膜密切相关。如何维护菌斑的生态平衡是龋病防治的关键，有效的抗龋治疗不能对有益的共生菌造成危害，因此自溶途径有望成为抗龋治疗的潜在靶点[6-7]。

2006年，Håvarstein等[8]发现肺炎链球菌自溶酶LytA与细菌压力耐受密切相关。在酸性、抗生素等多种压力下，LytA表达增强，作为分泌蛋白溶解其他细菌的同时产生保护机制使自身免于溶解；通过清除“老弱病残”的同种细菌并拮抗其他种类的细菌，同时获得外源性DNA与生长所需营养物质，减少细菌间的竞争压力[8-9]。LytA的作用机制被认为是肺炎链球菌应对环境压力的重要应答反应，对细菌的生存竞争具有重大意义[8,10-11]。

有研究发现，S.gordonii通过产生多种蛋白水解酶、过氧化氢及细菌素可抑制变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）的过度生长与毒力因子的产生[5]；临床研究也证实，当牙菌斑生物膜中检出高比例的S.gordonii时，变异链球菌产酸及细菌毒力作用能够被有效地抑制[12]。AtlS是S.gordoniisg2013蛋白，因其能够溶解S.gordonii的细胞壁肽聚糖而命名。Liu等[3]已经证实，S.gordoniiatlS与细菌形成感受态、耐酸耐氧密切相关，在培养了48 h的S.gordonii生物膜中可以检测到大量的AtlS蛋白，提示AtlS可能在菌斑生物膜中大量释放。在与变异链球菌的生存竞争实验中发现，加入AtlS重组蛋白可以明显提高S.gordonii拮抗S.mutans的能力[3]。由此推测，S.gordoniiAtlS的作用机制可能与肺炎链球菌LytA相似。

细菌的存在是龋病发生的先决条件，口腔中主要的致龋菌是S.mutans，它具有极强的产酸、耐酸及附着能力。菌斑中的S.mutans可使局部pH值下降至5.5以下，并能维持相当长的时间，同时避开唾液的缓冲作用，从而造成局部脱矿。在口腔链球菌中，S.gordonii是有益菌，具有拮抗S.mutans的作用。S.gordonii的atlS基因与S.mutans的atlA基因有36%的同源性。S.mutans的atlA基因与其生物膜形成有重要关系[13]，由此推测，atlS与S.gordonii的生物膜形成或许也有相关性[6]。

基于atlS基因在S.gordonii生存竞争及拮抗致龋菌中表现出来的重要作用，本实验运用FQ-PCR法研究S.gordonii的atlS基因在不同生长期及pH值下的表达差异，结果显示，细菌生长期和pH值是影响atlS基因表达的相关因素。在不同的生长期（对数生长早期、对数生长中期、对数生长晚期、稳定期）和不同pH值（7.0和5.5）下atlS基因均有表达，且表达量高低存在差异。从对数生长早期到稳定期，atlS基因表达量呈上升趋势，到稳定期达到最高水平；中性条件下的表达量高于酸性条件。

本实验发现，S.gordoniiatlS基因在细菌生长的不同阶段表达具有差异性，从对数生长早期到稳定期呈增长趋势。当细菌生长到稳定期时，细菌量达到最高值，atlS基因的表达也在稳定期达到最高，这可能与细菌数量不断增多有关。

菌斑在龋病的发生过程中起重要的作用是因为菌斑中可以积聚酸，当pH值下降到临界值（5.5）以下时，可造成羟磷灰石中的钙丢失，釉质脱矿。只有少数致龋菌如S.mutans可以在这种环境下继续生长并产酸[7,14]。Liu等[3]发现，AtlS可以增加S.gordonii的耐酸性，atlS缺陷株在酸性条件下不能生长。本实验发现，在中性或酸性条件下atlS基因都可以表达，但是atlS基因在临界pH值（5.5）时的表达不如其在中性条件下高，这可能会降低了当口腔处于易患龋环境时对S.mutans的拮抗作用。

本研究显示，pH值和细菌生长期均能影响atlS的表达，但需要进一步排除各种因素间的相互干扰，筛选调控atlS表达的主要因素并明确其作用机制，及以上因素对AtlS蛋白水解酶活性的影响。另外，还需筛选并验证调控atlS表达的关键分子通路，以了解外界因素是通过怎样的分子网络进行信号传递以调控atlS基因的表达。

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