茵陈总黄酮对四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤的保护作用

牛筛龙，吴之琳，姚晶晶

茵陈总黄酮对四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤的保护作用

牛筛龙，吴之琳，姚晶晶

目的 探讨茵陈总黄酮对四氯化碳(CCl4)致肝损伤模型大鼠的肝脏保护作用。方法 选择雄性清洁级SD大鼠112只，实验分为6组，即正常对照组、模型对照组、茵陈总黄酮低、中、高剂量组、阳性对照组(茵栀黄口服液组)。正常对照组12只,其余每组20只。测定大鼠的体重和存活率，测定大鼠血清的丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性、蛋白浓度及肝组织羟脯氨酸的含量，并取肝脏组织作病理检查。结果 茵陈总黄酮高剂量组大鼠血清ALT为(2659.8±923.8) nmol/(s·L)，与模型对照组(6274.3±2018.3)nmol/(s·L)相比显著性降低，且茵陈总黄酮各组大鼠血清ALT活性随剂量增加而降低。大鼠血清AST变化趋势与ALT相同。与模型对照组相比，茵陈总黄酮组的总蛋白和白蛋白浓度有所增加，而茵陈总黄酮各组肝组织病理学评分均有不同程度的降低(P<0.01)，其中高剂量组病理组织学评分为(1.92±0.79)，与模型对照组(3.86±0.43)相比降低得最明显，此外茵陈总黄酮还能降低肝组织羟脯氨酸含量及抑制肝纤维化作用。结论 茵陈总黄酮对CCl4所致大鼠慢性肝损伤具有保护作用。

茵陈总黄酮；慢性肝损伤；CCl4；肝保护

茵陈为菊科植物茵陈蒿幼苗的地上部分，二年生或多年生草本，早在《神农本草经》中就有记载并被列为上品，在全国各地均有分布。茵陈具有清湿热、利胆退黄的功效，被广泛用于治疗肝炎、胆囊炎等疾病。茵陈中含有多种化学成分，包括香豆素、黄酮、苯氧基色原酮、挥发油[1,2]。文献[3]报道，茵陈所含黄酮类成分具有很强的保肝、利胆活性。武警江苏总队医院药剂科2012-10至2014-05，对提取得到茵陈保肝活性的有效成分，即茵陈总黄酮进行分析研究，旨在探讨茵陈总黄酮对CCl4所致大鼠慢性肝损伤具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 选择雄性清洁级SD大鼠112只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，并饲养在第二军医大学实验动物中心动物房，动物合格证号：SCXK(沪)2013-0006号。动物饲养室内温度(22±2)℃；相对湿度40%～80%；空气经一万级过滤后每小时换气15次；光照为7:00～19:00明，19:00～7:00暗；饲料为标准大鼠颗粒饲料经高压蒸汽灭菌后由动物自由取食；饮用水为自来水经高压蒸汽灭菌后由动物自由饮用。实验分为6组，即正常对照组，模型对照组，茵陈总黄酮低、中、高剂量组，阳性对照组(茵栀黄口服液组)。正常对照组为12只，其余各组均为20只。

1.1.2 药物与试剂 茵陈总黄酮，棕褐色冻干粉，武警江苏总队医院药剂科提供，批号：20130311，密封避光置室温下保存。茵栀黄口服液，10 ml/支，北京双鹤高科天然药物有限责任公司，批号：272382，有效期2年，室温下遮光保存。橄榄油为黄棕色油状液体，化学纯，500 ml/瓶，国药集团化学试剂有限公司生产，批号：F20120320，密封置室温下保存。CCl4为无色透明液体，有特臭，易挥发，分子量153.82，分析纯，500 ml/瓶，江苏永丰化学试剂厂生产，批号：20111201。实验前用上述橄榄油配制成25%(V/V)的浓度密封置室温下保存。

1.1.3 实验仪器 电子天平(上海天平仪器厂，型号HA 1004)；超速离心机(日本日立公司，型号CP80WX)；全自动生化分析仪(日本日立公司，型号7080型)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠慢性肝损伤模型制备 取体重120～150 g的雄性SD大鼠112只，在适应性饲养1周后称量体重，做好标记，用25%(V/V)CCl42 ml/kg的体积在大鼠项背部进行皮下注射，每周注射2次(周三下午和周日上午)，连续注射12周。期间每周称量大鼠体重1次，并根据体重变化调整给药体积。

1.2.2 给药方法 (1) 正常对照组：皮下注射橄榄油2 ml/kg，每周2次，连续12周，自第5周起灌胃生理盐水 5 ml/kg，1次/d，连续给药8周；(2)模型对照组：皮下注射25% CCl42 ml/kg，每周2次，连续12周，自第5周起灌胃生理盐水5 ml/kg，1次/d，连续给药8周；(3)茵陈总黄酮低剂量组：皮下注射25% CCl42 ml/kg，每周2次，连续12周，自第5周起灌胃茵陈总黄酮167 mg/kg，1次/d，连续给药8周；(4)茵陈总黄酮中剂量组：皮下注射25% CCl42 ml/kg，每周2次，连续12周，自第5周起灌胃茵陈总黄酮500 mg/kg，1次/d，连续给药8周；(5)茵陈总黄酮高剂量组：皮下注射25% CCl42 ml/kg，每周2次，连续12周，自第5周起灌胃茵陈总黄酮1 000 mg/kg，1次/d，连续给药8周；(6)阳性对照组(茵栀黄口服液)：皮下注射25% CCl42 ml/kg，每周2次，连续12周，自第5周起灌胃茵栀黄口服液5 ml/kg，1次/d，连续给药8周。

1.3 观察指标 给药期间，每日观察各组大鼠的饲料消耗情况、饮水量、大便及毛发情况，每周称量大鼠体重1次，期间如有大鼠死亡不再另补。给药期满，令大鼠禁食过夜，仍自由饮水。实验前称取大鼠体重，摘眼球采全血，颈椎脱臼法处死大鼠，剖腹取出肝脏，称取肝脏重量，在肝左叶剪取一小块肝组织置微量离心管冷冻保存，编号，备测肝组织羟脯氨酸含量，另取一块肝组织置10%甲醛溶液中固定，待送病理组织学检查。实验结束后将全血以3 000 r/min的离心分离得血清，进行编号，待测肝功能各指标；计算肝指数，其计算方法如下：

肝指数(%)=肝脏重量(g)/体重(g)×100%

实验结束后血清标本送第二军医大学新药评价中心用全自动生化分析仪测定ALT、AST、血清总蛋白(total serum protein， TP)、血清白蛋白(serum albumin，AlB)含量。肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量由南京建成生物工程公司代为检测，所得蛋白单位为μg/mg。

肝组织病理学检查由南京医科大学病理学系完成，采用石蜡包埋切片、HE染色，光镜检查，并对每张病理切片进行评分。评分标准：(1)0分，肝组织为正常结构，无病变；(2)1分，肝细胞局限性肿胀、纤维化，大部分肝小叶再生；(3)2分，肝细胞肿胀、纤维化较轻，肝细胞再生较多；(4)3分，肝细胞肿胀、纤维化，有炎性反应细胞浸润，肝细胞再生少；(5)4分，肝细胞弥漫性肿胀、纤维化，脂肪变性，间质有炎性反应细胞浸润。

2 结 果

2.1 一般情况及死亡情况 与正常对照组比较，模型对照组，茵陈总黄酮低、中、高剂量组和阳性对照组的大鼠的进食量均减少，毛发少光泽，体重增长速度慢，在实验结束时，各组的平均体重均明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。死亡大鼠在临死前均呈现恶液质状态，系因肝脏中毒后大鼠食欲明显降低所致。实验结束前，正常对照组12只大鼠全部存活，无一只死亡；模型对照组和茵陈总黄酮低剂量组各死亡5只，每组有15只大鼠存活；茵陈总黄酮中、高剂量组及阳性对照组各死亡4只，每组有16只大鼠存活。各组的致死率差异无统计学意义。

表1 正常对照组与茵陈总黄酮各组CCl4致肝损伤大鼠治疗期间平均体重变化情况 (g;±s)

注：与正常对照组比较，①P<0.05, ②P<0.01

2.2 肝指数 正常对照组大鼠肝脏表面光滑，质软，肝脏无肿大，其余各组大鼠肝脏表面呈颗粒状，质地较硬，且颜色呈现淡黄色样，肝脏明显肿大，重量明显比正常对照组增加，肝指数亦明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；而茵陈总黄酮各组又均低于模型对照组，差异有统计学意义(表2)。

2.3 血清ALT变化 正常对照组大鼠血清ALT含量为(984.0±146.1) nmol/(s·L)。皮下注射CCl4各组大鼠血清ALT活性与正常对照组比均有明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。茵陈总黄酮低、中、高剂量组大鼠血清ALT活性分别为(3233.1±1124.6) nmol/(s·L)、(2855.0±1251.7)nmol/(s·L)和(2659.8±923.8) nmol/(s·L)，与模型对照组(6274.3±2018.3)nmol/(s·L)相比，茵陈总黄酮组大鼠血清ALT活性随茵陈总黄酮剂量的增加而降低，差异有统计学意义(P<0.01)。阳性对照组大鼠血清ALT活性为(3045.2±1131.7)nmol/(s·L)， 与模型对照组相比也显著降低(P<0.01，表3)。

表2 各组大鼠肝指数和肝组织病理学评分情况 (±s)

注：和正常对照组比较，①P<0.05, ②P<0.01；和模型对照组比较，③P<0.05, ④P<0.01

表3 各组大鼠血清ALT、AST和蛋白浓度的变化 (±s)

注：ALT：丙氨酸氨基转移酶，AST：天冬氨酸氨基转移酶，TP：血清总蛋白，ALB：血清白蛋白；与正常对照组比较，①P<0.05, ②P<0.01；与模型对照组比较，③P<0.05, ④P<0.01

2.4 血清AST变化 正常对照组大鼠血清AST活性为2762.3±459.4 nmol/(s·L)。皮下注射CCl4各组大鼠血清AST活性与正常对照组比均有明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。茵陈总黄酮低、中、高剂量组大鼠血清AST活性与模型对照组(6341.0±2859.7) nmol/(s·L)相比，血清AST活性随茵陈总黄酮剂量的增加反而降低，差异有统计学意义(P<0.01)。阳性对照组大鼠血清AST活性为(4302.2±2078.1)nmol/(s·L)，与模型对照组相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，阳性对照组大鼠血清AST活性变化趋势与ALT基本一致(表3)。

2.5 血清蛋白浓度改变 模型对照组和茵陈总黄酮低剂量组大鼠血清总蛋白浓度平均值明显低于正常对照组。茵陈总黄酮中、高剂量组血清蛋白浓度为(68.77±3.78)g/L和(66.40±6.23 )g/L，与正常对照组差异无统计学意义。茵陈总黄酮中、高剂量组与模型对照组相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。皮下注射CCl4各组大鼠血清白蛋白浓度均明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01，表3)，与模型对照组比较，茵陈总黄酮各组血清白蛋白浓度明显增加。

2.6 肝组织羟脯氨酸含量的改变 正常对照组和模型对照组的肝组织羟脯氨酸含量分别为(0.169±0.017)和(0.221±0.036)μg/mg，模型对照组明显高于正常对照组(P<0.01)。茵陈总黄酮低、中、高剂量组及阳性对照组肝组织羟脯氨酸含量分别为(0.188±0.041)、(0.166±0.025)、(0.161±0.019)、(0.180±0.033)μg/mg，与正常对照组比较均无显著性差异，而与模型对照组比较则显著性降低。结果表明茵陈总黄酮具有一定的抑制肝组织纤维化的作用。

2.7 病理组织学检查结果 正常对照组肝脏组织结构正常，未见肝细胞肿胀、肝细胞脂肪变性、肝细胞再生、肝纤维化、炎性反应细胞浸润等病理改变。模型对照组与正常对照组相比，肝细胞肿胀、肝细胞脂肪变性、肝纤维化的程度和炎性反应细胞浸润例数均显著增加。而茵陈总黄酮低、中、高剂量组均能不同程度改善CCl4所致大鼠肝脏损伤。其中，高剂量组改善肝脏组织结构作用最为明显，16例大鼠肝脏样本中，有5例未出现肝脏肿胀，5例未出现肝细胞脂肪变性，7例未出现肝纤维化，10例未出现炎性反应细胞浸润(表4)。

各组的病理组织学评分情况：正常对照组评分全部均为0分；模型对照组大鼠则全部均为4分；给予茵陈总黄酮或茵栀黄口服液治疗后，各组肝组织病理学评分均有不同程度的降低，其中茵陈总黄酮高剂量组和阳性对照组肝组织病理学评分，与模型对照组(3.86±0.43)相比降低明显，差异有统计学意义(P<0.01，表2)。

表4 各组大鼠病理组织学检查结果 (n)

注：A:-，B:+，C:++，D:+++(-表示未出现, + 表示出现, +越多表示出现程度越高)

3 讨 论

CCl4引起的肝损伤机制，系其进入体内后在肝内经混合功能氧化酶作用形成三氯甲基自由基，启动脂质过氧化作用而损伤肝细胞，长期反复多次作用后，可导致肝内纤维组织增生，并逐渐加重形成肝硬化[4-6]。由于肝细胞损伤，因而血清ALT和AST明显升高[7]。本研究结果表明，与模型组比较，茵陈总黄酮各组可明显降低该两种酶的活性，高剂量组血清ALT和AST分别为(2659.8±923.8)nmol/(s·L)、(3710.5±1352.6)nmol/(s·L)，明显低于对照药物茵栀黄口服液组ALT(3045.2±1131.7)nmol/(s·L)和AST(4302.2±2078.1)nmol/(s·L)，表明药物具有显著的肝细胞的保护作用。

血清总蛋白包括白蛋白和球蛋白，在肝脏受慢性损伤时，主要表现为总蛋白含量降低[8-10]，由于白蛋白主要在肝细胞内合成，所以白蛋白含量的下降尤为明显。本研究在给予茵陈总黄酮治疗后，低剂量组总蛋白含量略有下降，中高剂量组总蛋白均无下降，茵陈总黄酮各组白蛋白含量与正常对照组比较仍有所降低，但与模型组比较，则明显增加，说明茵陈总黄酮具有对肝细胞较好的保护作用，但并不能完全阻断毒物对肝细胞造成的损害。

羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白中，且在胶原蛋白中的含量较为恒定，占胶原蛋白中氨基酸含量的7.5%，因此可以用测定羟脯氨酸的含量来反映胶原蛋白的含量，测定肝脏羟脯氨酸含量能反映肝内纤维增生情况[11]。本研究发现，长期给予CCl4后，肝细胞坏死后伴随有间质结缔组织增生，因而肝组织羟脯氨酸的含量明显增加，如模型组即比正常对照组升高30.8%。但在给予茵陈总黄酮治疗后，由于其具有的保肝作用，肝细胞的坏死及结缔组织的增生有所减轻，因此肝组织羟脯氨酸的含量明显较模型组低。茵陈总黄酮高中低剂量组肝组织病理学评分明显低于模型组，也表明了受试药物的保肝作用。

综上所述，茵陈总黄酮对CCl4所致大鼠肝损伤具有良好的保护作用，且高剂量组的效果最好。本研究结果为茵陈总黄酮应用于肝损伤的治疗提供了理论基础和实验依据。

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(2014-08-08收稿 2014-12-19修回)

(责任编辑 郭 青)

Hepatoprotective effect ofArtemisiacapillarisThumb flavones extract on chronic liver injury induced by carbon tetrachloride in rats

NIU Shailong, WU Zhilin, and YAO Jingjing.

Department of Pharmacy, Jiangsu Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Yangzhou 225003, China

Objective To investigate the protective effect of total flavones ofArtemisiacapillarisThumb on chronic liver injury induced by subcutaneous injection of CCl4continually in rats. Methods The rats in experiment were divided into 6 groups as follows: normal control group (0.9% sodium chloride), model group, positive group (Yinzhihuang oral solution group), low, middle, and high dosage groups of total flavones of Artemisia capillaris Thunb. Body weight and survival rate of rats were determined. The serum sample and the liver tissue samples from all groups were collected for the biochemical and pathological examination, respectively. Results Animal serum ALT in high dose group ofArtemisiacapillarisThumb flavones extract was (2659.8±923.8) nmol/(s·L). It was significantly lower when compared with the model group (6274.3±2018.3) nmol/(s·L). Serum ALT activity decreased with increasing doses ofArtemisiacapillarisThumb flavones extract. Serum AST had same tendency as serum ALT. Compared with model group, concentration of total protein and albumin increased in the group ofArtemisiacapillarisThumb flavones extract. Liver tissue pathology score reduced to varying degrees (P<0.01). The score in high dose group was 1.92±0.79 and it was much lower than that in model group (3.86±0.43). In addition,ArtemisiacapillarisThumb flavones extract can also reduce the liver hydroxyproline content and inhibit liver fibrosis. Conclusions The total flavones ofArtemisiacapillarisThumb are effective in protecting the chronic liver injury induced by CCl4in rats.

total flavones ofArtemisiacapillaristhumb; chronic liver injury; carbon tetrachloride; hepatoprotective effect

牛筛龙，本科学历，副主任药师，E-mail: nsl77982@sina.com

225003扬州，武警江苏总队医院药剂科

吴之琳，E-mail: wuzhilin52@163.com

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