EGB761对VH-64尤文肉瘤细胞的促凋亡作用

李战宁，孟宏涛，闫 鲲，崔海斌，郭 义，刘 晶

EGB761对VH-64尤文肉瘤细胞的促凋亡作用

李战宁1，孟宏涛1，闫 鲲1，崔海斌2，郭 义2，刘 晶1

目的 研究银杏叶提取物EGB761对VH-64尤文肉瘤细胞的促凋亡作用。方法 EGB761干预VH-64尤文肉瘤细胞后，CCK- 8 观察 50、100 和200 mg/L不同浓度EGB761作用下VH-64尤文肉瘤细胞的增殖状况，流式细胞仪分析用AnnexinV-FITC和PI双染检测不同浓度EGB761对VH-64尤文肉瘤细胞凋亡的影响。结果 EGB761可抑制VH-64尤文肉瘤细胞的增殖，呈浓度和时间依赖性反应；EGB761 100 mg/L、200 mg/L干预VH-64尤文肉瘤细胞后，流式细胞仪检测显示细胞凋亡率分别为6.85%±0.36%和14.36%±0.23%，明显高于对照组(P<0.01)。结论 EGB761可诱导VH-64尤文肉瘤细胞凋亡。

EGB761；VH-64；尤文肉瘤；凋亡

银杏叶的功能主要是化浊降脂、通络止痛、活血化瘀、敛肺平喘等[1]，临床上现阶段主要用于心血管疾病的治疗。德国Schwabe制药公司于20世纪研发的产品EGB761及其标准的制定对银杏叶的研究进程产生了进一步的推动作用。EGB761 主要有效成分为黄酮苷(24%)和萜内酯(6%)，其作用是能清除自由基，也能提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性。但是其受到广大医学界学者普遍关注的却是其抗细胞凋亡作用，具有巨大的临床药用价值[2]。因为近年来有学者研究发现EGB761可以通过促进肿瘤细胞的凋亡，从而对肿瘤的生长速度有一定程度的控制，借此对肿瘤产生一定的治疗作用[3]。尤文肉瘤是一种多发于青少年的恶性肿瘤，EGB761对其作用尚不清楚，本实验拟用EGB761处理VH-64尤文肉瘤细胞，观察EGB761对肿瘤的作用，分析其作用的可能机制，为EGB761抗肿瘤的临床应用提供实验室证据。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)VH-64尤文肉瘤细胞购自武汉博士德生物工程有限公司；(2)EGB761(银杏叶提取物)购自南京博瑞公司，以二甲基亚砜(DMSO)稀释为所需浓度；(3)细胞凋亡与坏死检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，包括Hoechst 33342 染色液、碘化丙啶PI染色液和细胞染色缓冲液；(4)细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，包括膜联蛋白V、异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(PI)和结合缓冲液；(5)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、DMEM高糖培养液、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(Trypsin)均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将VH-64尤文肉瘤细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液(全培养液)，置于常规条件下培养，保持37 ℃、饱和湿度及5% CO2。

1.2.2 CCK-8 检测抑制细胞增值率 参照试剂盒所附方法，通过胰蛋白酶消化对数生长期的VH-64尤文肉瘤细胞，将细胞悬液浓度调整为 1.0×104/ml，每孔100 μl接种于 96孔板，培养条件为37 ℃、5% CO2。24 h后给每孔加0.5 mg/ml的 EGB761，使终质量浓度各为50、100、200 mg/L，每个浓度需设 5 个重复孔，另外还设等量的DMSO为对照组。不同的浓度各处理 12、24、48 h后，每孔各加入CCK-8 10 μl继续培养4 h。以相同的培养液作为空白对照并且调零，在450 nm波长下用酶标仪测定吸光度(OD)值，测 3 次，取其平均值减小误差。本实验细胞增殖抑制率计算公式为：细胞增殖抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.2.3 流式细胞仪Annexin V-FITC和PI双染检测细胞凋亡率 将对数生长期的VH-64尤文肉瘤细胞用胰蛋白酶消化，接种于 6 孔板，37 ℃、5% CO2条件下培养 24 h，按50、100、200 mg/L EGB761组分组处理，设DMSO对照组。处理24 h后收集VH-64细胞，调整VH-64细胞悬液浓度至1.0×105/ml，在试管中以预冷的结合缓冲液100 μl重悬细胞，冰浴；再加入5 μl AnnexinV - FITC和5 μl PI到每管VH-64细胞悬液中,混匀； 4 ℃避光条件下染色15 min；补加结合缓冲液490 μl并混悬细胞，然后快速用流式细胞仪来分析用药后各组VH-64细胞凋亡的不同比例。

2 结 果

2.1 CCK- 8 检测细胞增殖活性 EGB761(50 mg/L)处理对VH-64尤文肉瘤细胞的增殖无明显影响，与对照组相比无统计学意义(表1)；EGB761(100和 200 mg/L)处理 12 h、24 h、48 h则可不同程度抑制VH-64尤文肉瘤细胞的增殖，其抑制作用随浓度的升高或时间的延长而增高，并且与对照组相比较差异均有统计学意义(P<0.01)，与对照组相比较，Dunnett’s检验也有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同浓度EGB761作用12 h、24 h、48 h后VH-64 细胞增殖的抑制率 (%；

注：与对照组比较，①P<0.05

2.2 流式细胞仪Annexin-V FITC/PI 双染法检测细胞凋亡率 EGB761处理24 h后各组细胞凋亡率分别为：EGB761(50 mg/L)处理组(0.41±0.11)%；EGB761(100 mg/L)处理组(6.85±0.36)%；EGB761(200 mg/L)处理组(14.36±0.23)%；DMSO对照组(0.28±0.12)%。EGB761(50 mg/L)处理后细胞凋亡率无明显变化，与对照组相比差异无统计学意义(图1B)。EGB761(100、200 mg/L)处理则增高了VH-64尤文肉瘤细胞的凋亡率，与对照组相比差异均有统计学意义(P< 0.01；图1 C、D)。结果显示，随着浓度的增高细胞凋亡率也随之增高，表明两者有一定的剂量依赖性。

图1 不同浓度EGB761作用VH-64细胞24h后的凋亡检测结果

3 讨 论

尤文肉瘤是严重危害儿童和青少年健康的恶性肿瘤之一，单纯的手术、放疗或化疗效果并不理想，采用包含药物在内的综合疗法是较好的选择。为了筛选新的抗尤文肉瘤药物，本实验检验了从银杏叶制备的主要有效成分为黄酮苷和萜内酯的EGB761对VH-64尤文肉瘤细胞的作用，初步证明该药物可诱导细胞凋亡，对尤文肉瘤细胞有较强的抑制作用。

已报道的实验研究结果显示，EGB761能够抑制某些肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡。银杏叶总黄酮对人肝癌HepG2细胞增殖具有抑制作用，并能诱导细胞调亡。其机制可能与银杏总黄酮有清除氧自由基的活性有关[4]。另外还有实验证明，EGB761的有效成分黄酮类化合物通过抑制女性乳腺癌和男性前列腺癌细胞FAS表达，可以使肿瘤细胞出现脂肪合成障碍，从而导致肿瘤生长速度受限，凋亡比例增加[5]；也有报道显示，EGB761可以促进P53 基因表达升高而诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥其抗肿瘤的作用[6，7]。细胞凋亡是生命的基本特征之一，而肿瘤的发生与细胞凋亡受阻有密切关系[8]。本实验用不同浓度的EGB761以不同的时长处理VH-64尤文肉瘤细胞，结果表明，EGB761对尤文肉瘤细胞增殖也有较强的抑制作用，并且抑制过程中有明显的细胞凋亡出现，而且与处理时长关联，呈现剂量依赖效果。这些结果说明EGB761用于治疗尤文肉瘤有较好的前景，也进一步说明EGB761有较广泛的抗癌谱。

EGB761可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，提示我们EGB761用于抑制尤文肉瘤是一个可能的选择。鉴于本实验中细胞系之间可能有所差异，笔者下一步将采用VH-64尤文肉瘤细胞以外的尤文肉瘤细胞系来进一步验证EGB761对尤文肉瘤的效果，并探索其具体的应用方法和剂量。

除了可以诱导肿瘤细胞凋亡，EGB761还可通过其他途径抗肿瘤。Watari等[8]的研究发现，EGB761抑制肿瘤细胞的增殖作用可能是通过增强机体的抗氧化能力和抑制肿瘤血管的形成而实现，这是因为肿瘤的发生与体内氧自由基的产生以及清除障碍有关[9]。而Redondo等[10,11]发现EGB761可增强淋巴细胞线粒体脱氢酶的活性和中性粒细胞过氧化酶的释放，从而增强机体细胞的免疫功能进行抗肿瘤，而且其抑制作用具有时间、浓度的依赖性。EGB761抑制VH-64尤文肉瘤细胞增殖、诱导其凋亡是否与这些途径有关，还有待下一步研究。

尤文肉瘤危害性较大，其发生和发展与细胞凋亡有着密切关系。所以筛选能够促使尤文肉瘤凋亡的高效药物，将可为抗击尤文肉瘤提供一种有效的临床治疗方法。本实验初步证明，从银杏叶提纯的EGB761能明显抑制VH-64尤文肉瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，从而为该肿瘤的临床治疗提供了新的思路和实验室证据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：296-297.

[2] 夏哓晖，张 宇，郗砚彬，等.银杏叶化学成分研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2009，15 (9)：100-104.

[3] Bi J, Guo A L, Lai Y R,etal. Overexpression of clusterin correlates with tumor progression,metastasis in gastric cancer:a study on tissue microarrays[J]. Neoplasma，2010, 57(3): 191-197.

[4] Park S G, Jung S, Ryu H H,etal. Role of 14-3-3-beta in the migration and invasion in human malignant glioma cell line U87MG[J]. Neurol Res, 2012, 34(9): 893-900.

[5] Senthilkumar K, Arunkumar R, Elumalai P,etal. Quercetin inhibits invasion, migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line (PC-3)[J]. Cell Biochem Funct，2011, 29(2): 87-95.

[6] Pradhan S J, Mishra R, Sharma P,etal. Quercetin and sulforaphane in combination suppress the progression of melanoma through the down-regulation of matrix metalloproteinase-9[J]. Exp Ther Med, 2010, 1(6): 915-920.

[7] Lamoureux F, Thomas C, Yin M J,etal. Clusterin inhibition using OGX-011 synergistically enhances Hsp90 inhibitor activity by suppressing the heat shock response in castrate resistant prostate cancer[J]. Cancer Res, 2011, 71(17): 5838-5849.

[8] Watari H, Kinoshita R, Han Y,etal. Prognostic significance of clusterin expression in advanced stage cervical cancer treated with curative intended radiotherapy[J]. Int J Gynecol Cancer，2012，22(3):465-470.

[9] Watari H, Kanuma T, Ohta Y,etal. Clusterin expression inversely correlates with chemosensitivity and predicts poor survival in patients with locally advanced cervical cancer treated with cisplatin-based neoadjuvant chemotherapy and radical hysterectomy[J]. Pathol Oncol Res，2010，16(3): 345-352.

[10] Redondo M, Rodrigo I, Alcaide J,etal. Clusterin expression is associated with decreased disease-free survival of patients with colorectal carcinomas[J]. Histopathology，2010, 56(7): 932-936.

[11] Girard F P, Byrne J, Downes M,etal. Detecting solube clusterin in vitro and in vivo models of prostate cancer[J]. Neoplasma，2010, 57 (5): 488-493.

(2014-12-09收稿 2015-02-20修回)

(责任编辑 岳建华)

Effection of EGB 761 to apoptosis of Ewing’s sarcoma VH-64 cellinvitro

LI Zhanning1, MENG Hongtao1, YAN Kun1,CUI Haibin2,GUO Yi2, and LIU Jing1.

1.Medical Department, Shanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054,China; 2. Hygiene Division of Logistics Department, Shanxi Provincial Corps of Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054,China

Objective To explore the contribution of EGB761 to the proliferation and apoptosis of Ewing’s sarcoma VH-64 cell in vitro. Methods CCK-8 assay was used to measure 50，100 and 200 mg/L which its effects on the proliferation of Ewing’s sarcoma VH-64 cell cultured with different concentrations of allicin for 12 h, 24 h, 48 h, AnnexinV-FITC and PI assay by flow cytometer (FCM) were applied to detect the apoptosis induced by EGB761. The changes of cell cycle were detected by FCM. Results EGB761 suppressed the proliferation of Ewing’s sarcoma VH-64 cell in a concentration-and time-dependent manner EGB761 induced cellular apoptosis of the Ewing’s sarcoma VH-64 cell in a concentration-dependent manner. With EGB761 100, 200 mg/L intervention Ewing’s sarcoma VH-64 cell, flow cytometer (FCM) test showed that the cell apoptosis rate were 6.85%±0.36% and 14.36%±0.23%,which were significant higher than that of control group (P< 0.01). Conclusions EGB761 significantly suppresses the growth of Ewing’s sarcoma VH-64 cell, induces the apoptosis of Ewing’s sarcoma VH-64 cell. Therefore resveratrol may be considered as a possible treatment medicine for Ewing’s sarcoma.

EGB761;VH-64 cell; Ewing’s sarcoma;apoptosis

李战宁，硕士，主治医师，E-mail：lizhanning316@126.com

1.710054 西安，武警陕西总队医院医务处；2.710054 西安，武警陕西总队后勤部卫生处

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