猪microRNAs鉴定方法和功能研究进展

杨滨宇 甘 玲 梅宏远

(西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 402460)

microRNA(miRNA)是一种功能上相对保守且由17～25个核苷酸(nt)组成的具有调控功能的非编码RNA，其表达模式具有分化的时序性及位相性［1］。研究发现，miRNA参与了生物机体中一系列重要的生物学过程，如细胞发育分化、肌肉发育、脂肪代谢、激素分泌和病毒感染等。对miRNA的挖掘鉴定及其功能的研究已成为科学关注的焦点。近几年的研究中，以猪作为模型动物的相关研究备受关注，且得到了广泛认可。猪miRNAs的研究相对较晚，但随着猪全基因组的不断完善以及大数据时代的来临，猪miRNAs的鉴定极大地促进了miRNA功能的研究。

1 猪miRNAs的鉴定方法

miRNA的鉴定是其功能研究的前提。最早发现的miRNA(lin－4)是通过正向遗传学筛选得到的，这种方法准确性高但是会遗漏一些不具有表型差异的miRNA。随着科学技术在不同领域的延伸和发展，更多的miRNA随之被发现，这些技术相应地被应用于猪miRNA的鉴定上来。

1.1 基因克隆技术

基因克隆技术需构建miRNA的cDNA文库，然后对扩增产物进行克隆、测序并与基因组数据库基于局部比对算法的搜索工具(BLAST)比对，排除非miRNA后，利用Northern印迹法最终确认。Alavala等［2］通过基因测序构建了猪心脏、肝脏和胸腺miRNA的cDNA文库并通过克隆技术共确定了120个具有保守性的同源miRNA基因。Cho等［3］在猪骨骼肌和脂肪的cDNA文库中共确定了15个新miRNA。常规的基因克隆技术在建立cDNA文库时需要几百微克RNA，操作繁琐，工作量大。因此，研究者们对该方法进行了改进，他们利用flashPAGE分馏器和预制凝胶在10 μg总RNA中提取了40 nt的miRNA，然后通过组合式PCR并利用多联基因克隆技术确定了猪空肠、回肠、脾以及31日龄仔猪肾中的10个新的miRNA［4］。

克隆技术可以准确地确定每一个miRNA，但是分离miRNA的步骤繁琐且一些低丰度表达的miRNA很难被检测到。另外，由于miRNA表达具有组织特异性和阶段性，通过建立cDNA文库寻找一些暂时表达或具有组织特异性的miRNA具有一定的局限性［5］。

1.2 杂交检测技术

1.2.1 Northern 杂交技术

Sawera等［6］采集猪的小脑、大脑皮层、海马、肾以及仔猪肝脏并提取RNA，对提取的RNA利用ɑ－32P三磷酸脱氧尿苷和T7核糖核酸聚合酶进行体外转录，通过闪烁计数器测定标记了放射物的核苷酸浓度从而完成了miRNA的探针设计，最后利用Northern印迹杂交技术所得到的数据确定了miR17－92 基因簇中的 miR－17、miR－18、miR－19a、miR－20、miR－19b、miR－91 和 miR－92 在猪组织中表达，这也是最早被确认的猪miRNA。Northern杂交是鉴定miRNA的经典方法，但因操作复杂，影响了检测效率，不适合用于高通量分析。另外，尽管无放射性探针代替放射性探针的标记方法已经被广泛使用，但因常规的Northern方法特异性和灵敏度不高，研究者们便利用锁核酸(LNA)来代替核苷酸作为探针修饰的方法以提高其特异性和灵敏度。当前，在猪miRNAs检测中基于LNA的检测技术已被广泛使用。

1.2.2 微阵列芯片技术

微阵列芯片技术是一种可以实现高通量分析的检测方法，将大量miRNA序列互补寡核苷酸分子同时固定于支持物上，然后与标记过的样本RNA进行杂交，最后通过信号强弱检测进而判断样品中靶分子的数量。Zhou等［7］利用微阵列芯片技术在猪骨骼肌组织中共检测到16个新发现的miRNA和31个已知的miRNA，为进一步的研究提供了重要的分子信息。

核苷酸分子和样本分子间产生交叉反应是常规微阵列技术的弊端，这将导致检测结果准确率低且重复性差［8］，研究者们便对这种方法进行了很多改进。Soroush等［9］利用了微液相miRNA技术检测了猪小肠中已被发现的332种肠道miRNA，并新发现一个miRNA且表明其前体位于第1、3号染色体。猪的 miR－135a－135b基因簇则是利用LNA miRNA芯片技术发现的［10］，此类鉴定为进一步确定该基因簇的功能奠定了基础。

miRNA芯片技术利用大规模微阵列对已知的miRNA进行检测，大大地提高了筛选的速度和通量，与以上方法相比较，miRNA芯片技术优点突出，是一种快速有效的miRNA检测方法。

1.3 生物信息学预测

该方法可以对表达量低、无法直接克隆的miRNA进行预测［11］。但生物信息学方法预测得到的miRNA需要通过试验进行验证。Xie等［12］对不同阶段长白猪的背最长肌、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、胃和小肠中的miRNA进行生物信息学分析，在分析的57个miRNA中发现2种新miRNA且有39个miRNA在猪上未见报道。通过荧光定量PCR方法进行验证，数据结果表明在所采样组织中 miR－181b 和 let－7e 均 有 表 达，let－7、cmiR－125b、miR－new1 和 miR－new2 仅在几种组织中表达，而miR－122和miR－206分别在肝脏和肌肉中特异性表达。检测通量大、速度快是生物信息学预测的特点。随着各物种全基因序列测序工作的完成，生物信息学方法逐渐成为鉴定miRNA的有效方法。

1.4 高通量测序

高通量测序技术集合了以上几种方法的优点，并可以一次性对几百万条DNA分子进行序列测定，在检测和鉴定miRNA上具有极大优势。猪miRNA的鉴定工作在不同种类的高通量测序技术的支持下得到了巨大的发展。例如:Li等［13］通过Solexa测序确定了荣昌猪背部皮下脂肪中227个保守的miRNA，其中有59个是新发现的miRNA;Li等［14］采集了第210天的藏猪卵巢和睾丸的样本，利用Illumina测序技术检测了732个miRNA，其中新发现78个 miRNA;Oriol等［15］利用 Roche/454 FLX技术在欧洲伊比亚品种、欧洲野猪、长白、大白、皮兰特、梅山猪和越南猪的肾脏组织中的229个miRNA中发现了110个新miRNA;Bai等［16］利用SOLID测序技术检测了阉割与非阉割的皮兰特和长白二元杂猪在第161天的背部皮下脂肪中的 366个 miRNA，其中新发现 192个miRNA。高通量测序技术的高准确性、高通量和高灵敏度等突出优势，对挖掘和鉴定猪新miRNA做出了突出贡献。

2 猪miRNAs功能研究进展

2.1 生产性能

以往的很多研究已证明miRNA参与了猪的肌肉发育、脂肪代谢等多个与生产性能相关的生物学过程。下面主要概述近年来miRNA与猪生产性能的相关研究。

在猪的肌肉发育方面，相关研究表明miR－1和miR－206在长白杜洛克杂交猪老龄化肌源干细胞中表达量降低，而miR－24的表达量增多。同时指出miR－24表达量升高可能与维持肌源干细胞静止从而避免衰老有关［17］。Yang 等［18］研究了桐城猪和长白猪在产前和产后肌肉中miR－127的动态表达，结果表明，桐城猪在胚胎期第45～85天时的miR－127表达量高于长白猪;仔猪在出生后的第20～160天，桐城猪的miR－127表达量普遍高于长白猪，但差异不显著。由此表明miR－127在桐城猪(肥胖型猪)胚胎肌肉发育中后期发挥的作用比长白猪(瘦肉型猪)大。此外相关研究表明在去势猪的背最长肌中 miR－1、miR－133b 和 miR－133a 的表达量明显下降，miR－206表达量增加且可以促进骨骼肌再生，同时还表明let－7c和let－7a与去势猪的脂肪沉积有关［19］。

在猪脂肪代谢方面，Li等［20］研究了 miR－181a与脂肪生成因子肿瘤坏死因子－α(TNF－α)之间的关系。结果表明，miR－181a可以加速脂滴的积累，增加甘油三酯的含量，并抑制TNF－α蛋白质的表达;此外，miR－181a也可以抑制脂肪合成相关基因以及脂解基因的表达。此暗示miR－181a可能作为抗肥胖药物治疗的新靶点。此外，Jeong等［21］研究表明miR－302a表达量与脂肪细胞基因脂肪酸结合蛋白(AP2)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达呈负相关。

在母猪生产性能方面已有证据表明外来体miRNA可以通过母乳传递给仔猪，母乳中免疫相关miRNA可以通过消化道转移到仔猪体内［22－23］，但是相关研究报道较少。伴随通过哺乳所传递的miRNA在仔猪的免疫系统发育中的分子机制研究的深入，必将为提高仔猪存活率等生产指标提供新思路。此外还有研究表明miR－92a可以抑制卵巢颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁，这有利于母猪排卵和提高产子数量［24］。

目前，对于猪生产性能相关miRNA的研究，一方面在继续进行深度挖掘鉴定及相关作用机理的解释;另一方面对于miRNA的研究也逐渐趋向于多样化，动态化及细致化。

2.2 垂体激素分泌

目前，miRNA参与猪脑垂体激素调控的研究相对较少，但其研究意义不可忽视。Ye等［25］研究猪脑垂体中miRNA的差异表达与卵泡刺激素(FSH)之间的关系时，构建了猪脑垂体细胞模型，并发现促性腺激素释放激素(GnRH)可以促进miRNA的转录和FSH的分泌。在GnRH作用下，通过微阵列技术和 qPCR结果分析表明，ssc－let－7c、ssc－miR－361－5p、ssc－423－3p、ssc－miR－425－3p 和ssc－miR－45 表 达 量 上 调，而 ssc－miR－30e－3p、sscmiR－320、ssc－miR－324 和 ssc－miR－361－3p 表达量下调;差异表达的miRNA进行途径影响试验的研究表明，miRNA可能与GnRH调控途径有关。其中已证实miR－361－3p靶标位置是 GnRH的信号“开关”基因。最重要的是，功能研究结果表明miR－361－3p参与了FSH分泌的调节。在之后的研究中Qi等［26］又指出 ssc－let－7c 参与促生长素(GH) 的分泌调节，过量表达的ssc－let－7c可以抑制猪垂体前叶细胞分泌GH。

2.3 参与疾病调控

miRNA参与了猪疾病发生机制。研究表明miRNA在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染过程中扮演着不同的角色。miRNA可以抑制PRRSV的复制，但其作用机理各不相同。miR－181家族中的miR－181c对PRRSV的复制最为强烈，它主要通过靶标作用于PRRSSV基因组从而抑制其复制［27］，随后研究者对猪的其他部位进行PRRSV病毒含量检测，结果发现 miR－106、miR－140－3p、miR－18、miR－181、miR－338 和 miR－93 表达量出现差异，暗示了这些miRNAs与抑制PRRSV复制有关。需指出的是 miR－181和 miR－338特定地在脑中表达，这表明这些组织特异性miRNA可能影响相应组织中PRRSV的感染。miR－125b并不直接靶向作用于PRRSV的基因组，而是通过抑制核转录因子－κB(NF－κB)的活化而达到抑制PRRSV复制的效果［28］。miR－26家族均对 PRRSV的复制具有强烈抑制作用，其中miR－26a在PRRSV感染过程中可以作用于Ⅰ型干扰素和干扰素刺激基因MX1和ISG15，从而抑制1型和2型PRRSV毒株的复 制［29］。此 外 miR－23、miR－378、miR－505 和miR－506 对 PRRSV 复 制 也 有 抑 制 作 用［30－31］。miRNA还可受PRRSV的调节而改变其表达。Hicks等［32］研究了PRRSV感染猪后巨噬细胞的miRNA 组表征，研究发现 miR－30a－3p、miR－132、miR－27b、miR－29b、miR－146a 和 miR－9－2 在巨噬细胞中表达量发生改变，而在巨噬细胞中被高度抑制表达的miR－147与PRRSV之间的关系尚需进一步考证。

miRNA在猪疾病中还扮演着基因调节剂的作用。Hoeke等［33］在仔猪感染沙门氏菌的回肠中发现miRNA主要调控细胞的焦点粘连以及肌动蛋白细胞骨架的通路。研究表明，miR－29a可以介导肠上皮细胞繁殖导致Cdc42表达量下调和介导Caveolin－2调节。Caveolin－2参与许多致病性细菌和病毒的内吞过程，而Cdc42可以调节细胞骨架结构、细胞生长、细胞极性以及细胞内运输等。此项研究提出了一种可以通过miRNA调节细胞摄取病原体数量来替代常规治疗策略的假设。此外，还有研究表明miR－155在胸膜肺炎放线杆菌感染猪的肺组织中参与了炎症反应的调节［34］;miR－21可以直接靶标作用于IP－10基因抑制猪伪狂犬病毒在 PK－15细胞中的复制［35］等。总之，miRNA在猪疾病发展过程中的作用，将为猪疾病的防治提供新的思路和靶标。

3 小结与展望

miRNA在猪机体内广泛分布且不同miRNA在个体发育的不同阶段产生，广泛参与各生理功能的调控。其鉴定工作从繁琐低效转变成了简单高效，而功能的研究也更加全面。相信在未来的研究中，猪miRNAs鉴定和功能的研究一方面可以为养猪业带来福利，另一方面也可以为人类疾病的防治带来新的契机。

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