13种海南入侵植物提取物对降香黄檀炭疽病菌的抑制作用

2015-03-23周洁尘刘君昂何苑皞周国英

植物保护 2015年5期

周洁尘，刘君昂，何苑皞，周国英

（经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心，长沙 410004）

降香黄檀（Dalbergiaodorifera），又名黄花梨，濒危种，海南特产，豆科蝶形花亚科的常绿乔木［1］。炭疽病是降香黄檀最主要的病害之一，导致叶片逐渐干枯或穿孔，直至脱落，严重影响植株光合作用，以及芯材的形成，且常大面积暴发［2-3］。国内目前降香黄檀炭疽病的防治主要采用化学防治技术［4-5］，长期使用化学药剂不仅容易使病菌产生抗性，还易导致严重的环境污染［6］。植物源农药是从植物中提取有杀虫或抗菌作用的活性物质，直接或间接加工合成的新型农药［7-8］，其优点是对环境影响较小，残留少等。目前国内外研究者越来越重视植物源农药的研究与开发［9-12］，但针对降香黄檀炭疽病的植物源药剂还未见报道。

本文从13种海南入侵植物中，筛选出对降香黄檀炭疽病菌具有良好抑菌活性的植物，为降香黄檀炭疽病的药剂研制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试病原菌

病原菌菌种为本实验室从海南省澄迈国营林场的降香黄檀炭疽病叶中分离，单孢分离纯培养获得，鉴定为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。

1.1.2 供试植物

13种海南入侵植物［13-15］中，胜红蓟、飞机草、马缨丹、菊芹、含羞草、木薯皆采自海南省澄迈国营林场，其余植物分别采自海南省其他各市县。具体植物名录见表1。

表1 供试植物名录Table 1 Thirteen invasive plants tested in this study

1.2 植物粗提取物的制备

将各植物洗净后置于干燥通风处阴干至恒重，放入粉碎机中粉碎，过40 目筛。得到粉末置于40 ℃烘箱中24h后密封保存。

植物粗提物的制备采用冷浸法［16］，分别以乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯作为提取溶剂，固液比为1∶10，室温下浸泡3次，每次间隔时间3d，收集3次滤液进行旋转蒸发，干燥得到粗提物。加入适量无水乙醇溶解，再加蒸馏水，使乙醇浓度为10%，粗提物浓度为100mg／mL。置于冰箱内冷藏备用。

1.3 植物提取物抑菌活性测定

采用滤纸片法［17-18］。将病原菌接种于PD 培养液中，160r／min，28℃振荡培养4d后得孢子悬浮液。取0.2mL菌悬液加入PDA 平板上，涂布均匀。

用打孔器将滤纸打成直径6 mm 的圆形纸片，灭菌后置于植物提取物中充分浸泡。以10%乙醇溶液为对照。将浸泡后的滤纸片分别放入含菌培养皿中，28 ℃培养，每种药液重复3次。2d后观察测量抑菌圈直径，比较抑菌效果。选择抑菌效果较好的3种植物提取物进一步进行抑菌活性研究。

1.4 3种植物提取物对炭疽病菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法［19］，测定垂序商陆和胜红蓟的乙酸乙酯提取物、飞机草乙醇提取物对降香黄檀炭疽病菌的毒力。取100mg／mL植物提取物加入到灭菌的55℃PDA 培养基中，制成提取物浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50mg／mL的含药培养基，以加入等体积的10%乙醇溶液为对照，每处理重复3个培养皿。用6mm 打孔器在培养4d后的病原菌菌落边缘切取菌饼，接入含药培养基中于28 ℃培养箱中培养5d后，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率，并进行毒力分析，计算EC50。

菌丝生长抑制率（%）＝［（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）］／（对照菌落直径-菌饼直径）×100。

1.5 3种植物提取物对炭疽病菌菌丝形态的影响

挑取1.4培养的分别经垂序商陆和胜红蓟的乙酸乙酯提取物、飞机草乙醇提取物处理的病原菌菌落边缘菌丝体，放在载玻片上制成玻片标本。在光学显微镜下观察3种植物提取物对病原菌菌丝形态的影响并拍照［20］。

1.6 两种植物乙酸乙酯提取物对炭疽病菌生长量的影响

采用菌丝干重法［21］。取6个锥形瓶，加入等量PD 培养液，灭菌后分别加入适量垂序商陆和胜红蓟乙酸乙酯提取物，使其最终浓度为EC50，混匀后接入0.2mL炭疽病菌孢子悬浮液。160r／min，28 ℃振荡培养。分别于培养48、60、72、84、96、120h后取出一个锥形瓶，抽滤，得到的菌体置于60 ℃烘箱中烘干至恒重。重复操作3次，并设不加药液空白对照组。称量菌体干重并绘制生长曲线。

1.7 两种乙酸乙酯提取物最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）的测定

将适量100mg／mL植物提取物加入灭菌的55℃PDA 培养基中，制成提取物浓度分别为2.5、5、7.5、10、12.5 mg／mL 的含药培养基，以加入等体积的10%乙醇溶液为对照，每处理重复3个培养皿。移取0.2mL 菌悬液加入含药培养皿及对照培养皿中，涂布均匀后，置于28℃下培养。2d后观察病原菌生长情况，不长菌的最低浓度为提取物MIC。

将上述病原菌继续培养5d后观察，不长菌的最低浓度为提取物MBC［22］。

2 结果与分析

2.1 13种入侵植物粗提物对炭疽病菌的抑菌作用

由表2可知，同种植物的不同溶剂提取物抑菌活性差异较大。13 种植物中只有飞机草的4 种溶剂提取物都有一定的抑菌活性，但乙醇提取物的抑菌效果最好；空心莲子草、含羞草和繁缕对炭疽病菌没有抑菌作用。垂序商陆乙酸乙酯提取物抑菌效果最明显，胜红蓟乙酸乙酯提取物次之。

表2 13种植物4种溶剂提取物对炭疽病菌的抑菌圈直径Table 2 Inhibition zones of 13plant extracts with four solvents against Colletotrichum gloeosporioides on Dalbergia odorifera

2.2 3种入侵植物粗提物对炭疽病菌的毒力

表3和图1为不同浓度垂序商陆乙酸乙酯提取物、胜红蓟乙酸乙酯提取物和飞机草乙醇提取物对降香黄檀炭疽病菌的抑制作用结果。进一步分析抑菌效果最好的3种植物提取物的杀菌活性，发现抑菌作用随提取物浓度的增加而增强，在最低浓度3.125 mg／mL时，垂序商陆提取物的抑菌率接近50%，而胜红蓟与飞机草的抑菌率都较低；最高浓度50mg／mL时，垂序商陆与胜红蓟的抑制率均达到100%。

垂序商陆乙酸乙酯提取物对降香黄檀炭疽病菌有较强的抑菌作用，其EC50为3.413 mg／mL；胜红蓟乙酸乙酯提取物的抑菌作用略低，EC50为5.849 mg／mL；而飞机草乙醇提取物的EC50明显大于垂序商陆和胜红蓟，达到21.984mg／mL，说明飞机草提取物抑菌效果明显差于垂序商陆乙酸乙酯提取物和胜红蓟乙酸乙酯提取物。

表3 3种入侵植物提取物对炭疽病菌的抑菌率1）Table 3 Inhibition rates of 3invasive plant extracts against Colletotrichum gloeosporioides on Dalbergia odorifera

图1 不同浓度提取物对降香黄檀炭疽病菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of plant extracts at different concentrations against Colletotrichum gloeosporioides on Dalbergia odorifera

表4 3种入侵植物提取物对炭疽病菌的相对毒力Table 4 Toxicity of three plant extracts against Colletotrichum gloeosporioides on Dalbergia odorifera

2.3 3种入侵植物粗提物对炭疽病菌菌丝形态的影响

图2为降香黄檀炭疽病菌正常菌丝形态及药液处理后的菌丝形态。从图中可以看出，正常炭疽病菌菌丝长而舒展，粗细均匀且饱满，横隔明显且较长，两侧菌丝壁平行且光滑。而3种植物提取物处理组菌丝都表现出菌丝分支增多，菌丝长度变短。垂序商陆提取物处理菌丝内产生小液泡，菌丝畸形，横隔增多且分布不均匀，高浓度处理组细胞壁破裂，可能是由于横隔增多导致。胜红蓟提取物处理菌丝粗细不均，菌丝膨胀，高浓度处理组菌丝体也出现破裂。飞机草提取物处理分支较前两种植物多且菌丝短，两侧菌丝壁不规则，高浓度处理组菌丝交联、膨胀、严重畸形。

2.4 垂序商陆、胜红蓟提取物对炭疽病菌生长量的影响

根据图3可知，降香黄檀炭疽病菌经历适应期在72h后进入对数生长期，96h后进入衰亡期，含药培养基也呈现相同趋势。处理组药液浓度为2.2中提取物EC50，垂序商陆对病原菌菌丝生长量的抑制效果优于胜红蓟，其抑制率在50%以上，原因可能是液体培养基中菌丝与培养基接触更加充分，也更易受有毒物质影响。

2.5 垂序商陆、胜红蓟提取物最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）

从表5可知，垂序商陆提取物的MIC为5.0mg／mL，MBC 为10 mg／mL；胜红蓟提取物的MIC 为7.5mg／mL，MBC大于12.5mg／mL。垂序商陆提取物的杀菌作用强于胜红蓟提取物。

表5 最小抑菌浓度及最小杀菌浓度测定结果1）Table 5 The minimum inhibitory concentration and minimal fungicidal concentration

图2 3种植物提取物对炭疽病菌菌丝形态的影响Fig.2 Inhibitory effects of 3plant extracts on mycelium morphology of plant pathogen fungi

图3 垂序商陆及胜红蓟提取物对炭疽病菌生长量的影响Fig.3 Inhibitory effects of Phytolacca americana and Ageratum conyzoides extracts on hyphal increment of plant pathogen fungi

3 讨论

海南岛自然地理条件优越，产生了其多样性的生态系统，但也更易于入侵植物的入侵和扩散。据胡雪华等报道［23］，海南低海拔地区受飞机草、含羞草、胜红蓟等多种植物入侵。外来入侵物种危害入侵地的自然生态系统，降低物种多样性，对当地的社会、文化甚至人们的生活也产生严重影响［24］。植物中抑菌有效成分含量普遍较低，需要大量的植物进行植物源农药的研制，采用本土其他药用植物所需成本过高，而选用当地入侵植物不仅成本较低，还可变废为宝，有利于当地经济发展。本试验研究外来入侵植物的抑菌活性，发现10 种入侵植物对降香黄檀炭疽病菌有一定的抑菌效果。垂序商陆乙酸乙酯提取物的EC50为3.413 mg／mL，胜红蓟乙酸乙酯提取物以及飞机草乙醇提取物EC50分别为5.849、21.984mg／mL。

三种植物都有开发成植物源农药的潜力，尤其是垂序商陆，其乙酸乙酯提取物的MIC 和MBC 分别为5.0 mg／mL 和10 mg／mL。垂序商陆又名美洲商陆，目前在我国的分布较为广泛。杨帮等［25］发现垂序商陆的各部分都含有抑菌活性物质，医学上常用根作为泻下逐水的中药，具止咳、利尿、消肿功能。根据已有文献［26］，垂序商陆中主要抑菌成分是美商陆皂苷元，本试验采用提取物为粗提取物，所以有必要分离得到垂序商陆总皂苷，深入研究总皂苷中起主要作用的皂苷成分，并对其抑菌活性以及在菌体内部的作用位点进行探讨，为植物源农药的研制提供理论依据。

不同植物中所含的有效成分及含量不同，本试验仅用了4种有机溶剂进行提取，提取方法为冷浸法，其他溶剂及不同提取方法制备的提取物的抑菌活性还有待进一步研究。不同有效成分对微生物的作用位点不同，石志琦等［27］研究了蛇床子素对小麦赤霉病菌的抑制机制，推测其抑菌机理为蛇床子素阻断了Na＋内流，从而阻止了对葡萄糖的吸收；张龙等［28］的研究表明，仿生合成的拟银杏杀菌剂邻烯丙基苯酚（绿帝）和4-丁酰基苯酚（银泰）可使小麦纹枯病菌的菌丝分支间距明显缩短、菌丝伸长减慢。本试验中垂序商陆及胜红蓟不仅导致菌丝变形，甚至可导致细胞壁破裂。目前国内外植物提取物的研究多集中在室内研究，一些研究表明，离体条件下抑菌活性较强的植物提取物在自然条件下抑菌活性较低，这可能是由于自然环境中影响因素过多，所以如何将植物提取物有效应用于生产实践仍是一大难点。

［1］邱治军，周光益，陈升华.海南特有珍贵红木树种—降香黄檀［J］.林业实用技术，2004（6）：41-42.

［2］伍慧雄，庄雪影，温秀军，等.降香黄檀病虫害调查［J］.广东林业科技，2009，25（6）：86-88.

［3］桑利伟，刘爱勤，孙世伟，等.海南降香黄檀炭疽病病原鉴定及防治［J］.热带农业科学，2009，29（8）：23-25.

［4］李步斌.降香黄檀炭疽病与防治［J］.中国科技纵横，2013（2）：88-89.

［5］刘洪湾，李际，林秀莲.海南降香黄檀病虫害调查与防治［J］.农业灾害研究，2011，1（2）：32-33.

［6］沈寅出，张一宾.生物农药［M］.北京：化学工业出版社，2000：73-74.

［7］史卫国，徐之明，黄清臻，等.植物源农药的进展［J］.农药科学与管理，1997（3）：33-35.

［8］Martínez M L，von Poser G，Henriques A，et al.Simaroubaceae and Picramniaceae as potential sources of botanical pesticides［J］.Industrial Crops ＆Products，2013，44：600-602.

［9］冯俊涛，石勇强，张兴.56种植物抑菌活性筛选试验［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2001，29（2）：65-69.

［10］Suhaila M，Suzana S S，Ei S，et al.Antimyeotic screening of 58malaysian plants against plant pathogens［J］.Pesticide Science，1997，47：259-264.

［11］梁剑平，李蓉，卫增泉，等.六茜素及其衍生物抑菌活性的QSAR 研究［J］.中兽医医药杂志，2002（1）：13-15.

［12］孟昭礼，罗兰.人工模拟杀菌剂绿帝对8种植物病原菌德室内生测［J］.莱阳农学院学报，1998，15（3）：159-162.

［13］徐海根，强胜.中国外来入侵物种编目［M］.北京：中国环境出版社，2004.

［14］彭宗波，蒋英，蒋菊生.海南岛外来植物入侵风险评价指标体系［J］.生态学杂志，2013，32（8）：2029-2034.

［15］范志伟，沈弈德，刘丽珍.海南外来入侵杂草名录［J］.热带作物学报，2008，29（6）：781-792.

［16］殷帅文，王庆先，李强，等.20种植物提取物抑制植物病原菌活性研究［J］.天然产物研究与开发，2009，21（2）：306-311.

［17］李云雁，宋光森.板栗壳提取物抑菌作用研究［J］.林产化学与工业，2004，24（4）：61-64.

［18］王储炎.鹿蹄草提取物的抑菌作用和应用研究［D］.重庆：西南大学，2007.

［19］董红平，赵特，孙淑君，等.肉桂精油对4种重要果蔬病原真菌的生物活性研究［J］.中国生物防治学报，2014，30（2）：282-286.

［20］何静.苍耳提取物对有害生物抑制机理的研究［D］.兰州：甘肃农业大学，2005.