基于苍术属植物水溶性成分HPLC指纹图谱的化学亲缘关系研究

芮梦珏，欧阳臻*，彭华胜，赵 明，叶 丹，邵 扬，江 珊，杨淑芳，袁 婷

(1.江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013；2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230031；3.中国中医研究院 中药资源中心，北京 100700)

基于苍术属植物水溶性成分HPLC指纹图谱的化学亲缘关系研究

芮梦珏1，欧阳臻1*，彭华胜2,3，赵 明1，叶 丹1，邵 扬1，江 珊1，杨淑芳1，袁 婷1

(1.江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013；2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230031；3.中国中医研究院 中药资源中心，北京 100700)

采用高效液相色谱法建立不同产地的苍术属植物水提物不同极性部位的指纹图谱，并运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”及SPSS软件对其进行相似度评价及综合聚类分析，以探讨苍术属7种植物的种间亲缘关系。结果显示：茅苍术与罗田苍术聚为一类，北苍术与朝鲜苍术、部分茅苍术聚为一类，关苍术与白术聚为一类，鄂西苍术单独聚为一类，该聚类分析结果与以挥发性成分为指标的聚类分析结果一致。苍术属植物水溶性成分HPLC指纹图谱的建立及聚类分析可为苍术属植物的分类，寻找苍术属植物亲缘关系提供可靠依据。

苍术属；亲缘关系；HPLC；指纹图谱；综合聚类分析

菊科苍术属植物为多年生草本植物，主要分布在亚洲东部地区。我国有5种、1变种、1亚种[1-3]，即茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.) DC.、白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.、鄂西苍术Atractylodescarlinoides(Hand.-Mazz.) Kitam.、关苍术AtractylodesjaponicaKoidz.、朝鲜苍术Atractylodescoreana(Nakai) Kitam.、北苍术Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.和罗田苍术Atractylodeslanceasubsp.luotianensisS.L. Hu et X. F. Feng。苍术属植物是重要的药用类群，除了鄂西苍术外，其它所有类群的根状茎均作药用。中国是苍术属植物的主要分布区，长期以来，种间亲缘关系问题一直存在争议。肖培根[4]在药用植物亲缘学中提出植物亲缘关系与化学成分、疗效间存在一定的联系性。因此，探索苍术属植物化学成分的分布规律以探求其种间亲缘关系，对苍术属植物的合理利用具有重要指导意义。

目前，关于苍术属植物亲缘关系的研究主要集中在形态学、分子学及化学成分等方面，化学成分方面以挥发油为其主要研究对象，而对其水溶性成分方面的研究还未见报道。本课题组前期对苍术属植物的挥发性成分进行了GC-MS分析和指纹图谱研究，探讨了苍术属植物之间的亲缘关系，从挥发性成分的角度为苍术属植物的分类提供了依据。本研究采用HPLC法对7种37个不同产地苍术属植物水提物的三个不同极性部位进行分析，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版A”及SPSS20.0软件分析处理数据，构建亲缘关系系统图，从水溶性成分的角度探讨苍术属植物之间的亲缘关系，以期为苍术属植物的分类提供参考。

1 材 料

JASCO LC1500高效液相色谱仪(日本分光公司)；LXQ线性离子阱质谱仪(赛默飞世尔科技公司)；AE240分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；BuchiR-200型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；甲醇(色谱纯，国药集团)；双蒸水(娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(分析纯，国药集团)。

试验收集不同产地苍术属植物共37批，其中13批茅苍术A.lancea、9批北苍术A.chinensis、1批罗田苍术A.lanceasubsp.luotianensis、3批朝鲜苍术A.coreana、7批关苍术A.japonica、3批白术A.macrocephala、1批鄂西苍术A.carlinoides，由安徽中医药大学彭华胜教授鉴定。药材来源见表1。

表1 药材来源

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取苍术属植物药材粉末5 g，精密称定，加入15倍剂量的蒸馏水进行水煎煮，煎煮两次，第一次1.5 h，第二次1 h，合并滤液，浓缩至含生药量1 g/mL。依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对药材水煎液进行萃取，有机溶剂与水煎液的比例为1 ∶1，每一部位均萃取4次，合并萃取液并回收溶剂至干燥，分别加甲醇定容至2 mL、5 mL、5 mL，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位供试品溶液。

2.2 苍术属植物水提物石油醚部位HPLC指纹图谱研究

2.2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil-C18色谱柱(4. 6 mm×250 mm，5μm)；流动相甲醇(A)-水(B，含0.2%冰醋酸)梯度洗脱，0 min～12 min， 34%～42% A，12 min～25 min， 42%～54% A，25 min～38 min，54%～58% A，38 min～50 min，58%～60% A，50 min～55 min，60%～61% A，55 min～73 min，61%～71% A，73 min～83 min，71%～79% A，83 min～95 min，79%～85% A；流速为1.0 mL·min-1；检测波长313 nm；柱温30℃；进样量20 μL。

2.2.2 方法学考察

取本属代表物种茅苍术水提物石油醚部位供试品溶液进行方法学考查，结果符合指纹图谱要求。精密度试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.09%～1.47%和0.53%～2.31%(n=5)；24小时稳定性试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.47%～2.24%和0.11%～2.43%(n=5)；重复性试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.08%～2.47%和0.51%～2.16%(n=5)。

2.2.3 共有模式图的建立

以13批茅苍术样品指纹图谱为基础，生成共有模式图(图1)，根据各色谱峰的相对保留时间，确定12个共有峰，其中8号峰保留时间适中、分离效果好且峰面积较大，因此选8号峰为参比峰。

图1 茅苍术水提物石油醚部位共有模式图

2.2.4 指纹图谱的建立及相似度评价

将不同产地苍术属植物水提物石油醚部位样品的HPLC数据导入“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统2004版A”，生成苍术属植物水提物石油醚部位指纹图谱(图2)。以茅苍术的共有指纹图谱为参照图谱，对37批不同产地苍术属植物水提物石油醚部位指纹图谱进行了相似度分析，其结果见表2。由表可知，与共有模式图相比，茅苍术、罗田苍术的相似度较高，其平均相似度分别为94.3%、92.6%；其次为北苍术、朝鲜苍术、关苍术、白术，平均相似度分别为82.7%、81.9%、60.44%、48.3%；鄂西苍术相似度最低，为25.9%。

图2 苍术属植物水提物石油醚部位指纹图谱

样号相似度/%样号相似度/%样号相似度/%L197.9H192.6J165.5L297.3B187.9J258.2L397.2B287.3J364.4L496.7B386.2J464.1L596.3B484.6J563.8L695.8B583.9J657.0L795.2B680.5J750.1L894.2B779.7M151.0L993.1B879.4M247.9L1092.5B978.1M346.1L1191.5C183.8M425.9L1289.8C281.3L1388.8C380.8

2.3 苍术属植物水提物乙酸乙酯部位HPLC指纹图谱研究

2.3.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil-C18色谱柱(4. 6 mm×250 mm，5μm)；流动相甲醇(A)-水(B，含0.2%冰醋酸)梯度洗脱，0 min～6 min，12%～18% A， 6 min～17 min，18%～24% A，17 min～27 min，24%～30% A，27 min～37 min，30%～35% A，37 min～47 min，35%～41% A，47 min～57 min，41%～50% A，57 min～67 min，50%～63% A，67 min～83 min，63%～73% A，83 min～95 min，73%～83% A；流速1. 0 mL·min-1；检测波长 313 nm；柱温30℃；进样量20 μL。

2.3.2 方法学考察

取本属代表物种茅苍术水提物乙酸乙酯部位供试品溶液进行方法学考查，结果符合指纹图谱要求。精密度试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.3%～1.62%与0.64%～2.57%(n=5)；24 h稳定性试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.05%～1.68%与0.38%～2.58%(n=5)；重复性试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.16%～2.56%与0.38%～2.26%(n=5)。

2.3.3 共有模式图的建立

以13批茅苍术样品指纹图谱为基础，生成共有模式图(图3)，根据各色谱峰的相对保留时间，确定14个共有峰，其中5号峰保留时间适中、分离效果好且峰面积较大，因此选5号峰为参比峰。

图3 茅苍术水提物乙酸乙酯部位共有模式图

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度评价

将不同产地苍术属植物水提物乙酸乙酯部位样品的HPLC数据导入“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统2004版A”，生成苍术属植物水提物乙酸乙酯部位指纹图谱(图4)。以茅苍术的共有指纹图谱为参照图谱，对37批不同产地苍术属植物水提物乙酸乙酯部位指纹图谱进行了相似度分析，其结果见表3。由表可知，与共有模式图相比，茅苍术、罗田苍术的相似度较高，其平均相似度分别为93.4%、89.8%；其次为北苍术、朝鲜苍术、关苍术、白术，平均相似度分别为81.2%、80.7%、62.0%、61.1%；鄂西苍术相似度最低，为36.8%，此结果与石油醚部位的相似度评价一致。

图4 苍术属植物水提物乙酸乙酯部位指纹图谱

样号相似度/%样号相似度/%样号相似度/%L197.5H189.8J164.9L297.3B188.0J264.0L396.3B287.4J366.9L496.8B383.0J465.8L596.3B481.2J558.8L694.6B580.0J656.7L793.8B679.8J756.9L893.4B777.8M160.6L994.3B876.7M262.2L1090.8B976.9M360.4L1189.2C181.3M436.8L1288.8C279.1L1385.9C381.9

2.4 苍术属植物水提物正丁醇部位HPLC指纹图谱研究

2.4.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil-C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)；流动相甲醇(A)-水(B，含0.2%冰醋酸)梯度洗脱，0 min～10 min，1%～5% A，10 min～22 min，5%～7% A，22 min～28 min，7%～18% A，28 min～37 min，18%～21% A，37 min～50 min，21%～29% A，50 min～60 min，29%～37% A，60 min～70 min，37%～44% A，70 min～79 min，44%～62% A，79 min～84min，62%～69% A，84 min～99 min，69%～88% A，99 min～105min，88%～97% A；流速1. 0 mL·min-1；检测波长 282 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2.4.2 方法学考察

取本属代表物种茅苍术水提物正丁醇部位供试品溶液进行方法学考查，结果符合指纹图谱要求。精密度试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.41%～2.25%与0.26%～2.84%(n=5)；24 h稳定性试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.39%～2.96%与0.20%～2.03%(n=5)；重复性试验结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.16%～1.85%与0.08%～2.93%(n=5)。

2.4.3 共有模式图的建立

以13批茅苍术样品指纹图谱为基础，生成共有模式图(图5)，根据各色谱峰的相对保留时间，确定14个共有峰，其中7号峰保留时间适中、分离效果好且峰面积较大，因此选7号峰为参比峰。

2.4.4 指纹图谱的建立及相似度评价

将不同产地苍术属植物水提物正丁醇部位样品的HPLC数据导入“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统2004版A”，生成苍术属植物水提物正丁醇部位指纹图谱(图6)。以茅苍术的共有指纹图谱为参照图谱，对37批不同产地苍术属植物水提物正丁醇部位指纹图谱进行了相似度分析，其结果见表7。由表可知，与共有模式图相比，茅苍术、罗田苍术的相似度较高，其平均相似度分别为95.0%、90.0%；其次为北苍术、朝鲜苍术、关苍术、白术，平均相似度分别为84.9%、83.7%、72.5%、72.0%；鄂西苍术相似度最低，为54.5%。此结果与石油醚部位及乙酸乙酯部位的相似度评价一致。

图5 茅苍术水提物正丁醇部位共有模式图

图6 苍术属植物水提物正丁醇部位指纹图谱

样号相似度/%样号相似度/%样号相似度/%L198.1H190.0J176.6L297.2B189.8J274.1L397.6B287.9J375.1L496.7B386.7J471.3L596.6B486.3J571.0L696.1B585.1J669.7L796.0B684.3J769.9L895.6B782.6M172.6L995.4B881.3M272.5L1093.7B980.5M371.1L1191.3C184.5M454.5L1290.6C283.7L1390.4C383.1

2.5 苍术属植物水提物不同极性部位综合聚类分析

将不同产地的37批苍术属植物样品水提物石油醚部位的12个共有特征指纹峰，相对于参照峰(8号峰)的峰面积进行量化，得到37×12阶原始数据矩阵；乙酸乙酯部位的14个共有特征指纹峰，相对于参照峰(5号峰)的峰面积进行量化，得到37×14阶原始数据矩阵；正丁醇部位的14个共有特征指纹峰，相对于参照峰(7号峰)的峰面积进行量化，得到37×14阶原始数据矩阵；综合37个样品的三个不同极性部位共有特征峰的相对峰面积量化数据，可以得到37×40阶原始数据矩阵，由SPSS软件作聚类分析，结果见图7。

注：J1～J7关苍术；M1～M3：白术；B1～B9：北苍术；C1～C3：朝鲜苍术；L5～L13：茅苍术；H1：罗田苍术；E1：鄂西苍术

图7 不同产地苍术属植物综合聚类分析

从图7可以看出，37批样品可以聚为四类：安徽、湖北、河南茅苍术与罗田苍术聚为一类；江苏茅苍术与北苍术及朝鲜苍术聚为一类；关苍术与白术聚为一类；鄂西苍术单独聚为一类。其中茅苍术和罗田苍术先与北苍术和朝鲜苍术聚为一类后，再与关苍术和白术聚类，最后与鄂西苍术聚类。

3 讨 论

我国拥有丰富的苍术属资源，但其亲缘关系研究一直存在争议，目前已有的分类研究结果不完全一致，且收集的药材样品都不够全面，没有包含苍术属植物所有的类群。本实验收集了苍术属植物全部7个类群，对37个不同产地苍术属植物水提物不同极性部位进行综合聚类分析，结果表明：茅苍术与罗田苍术聚为一类，关苍术与白术聚为一类，北苍术与朝鲜苍术以及部分茅苍术聚为一类，鄂西苍术单独聚为一类，该结果与本课题组前期对不同产地的苍术属植物挥发油类成分的分析结果相一致。

茅苍术与北苍术、罗田苍术的亲缘关系 2010年版《中国药典》[5]记载苍术为茅苍术或北苍术的干燥根茎。傅舜谟[6]对苍术属植物的挥发油进行分析，认为将北苍术定为变种较合适。郭兰萍[7]等用RAPD方法在分子水平上对南北苍术的划分进行探讨，认为以地域为界划分南北苍术有一定道理。本实验研究结果显示安徽、湖北、河南的茅苍术样品聚为一类，河北、辽宁、山东、陕西、山西、内蒙的北苍术样品另聚一类，支持前人将南、北苍术划分开的观点，该结果与本课题组[8]前期采用GC-MS对南北苍术挥发油成分进行分析的聚类结果一致，与邹小兴[9]通过ITS区序列构建的系统树表明茅苍术和北苍术遗传关系较远的结果也一致。

胡世林[2]依据形态特征及挥发油含量的差异，将分布于大别山区海拔600 m以上的苍术定名为新的地理亚种—罗田苍术。邹小兴[9]通过ITS序列分析与atpB- rbcL、psbB-psbF 和trnL-trnF间隔区的序列分析，表明罗田苍术与茅苍术两者之间的遗传距离值非常小，亲缘关系密切。本实验结果显示，罗田苍术与茅苍术聚为一类且相似度最高，支持邹小兴罗田苍术与茅苍术亲缘关系较近的观点。

北苍术与朝鲜苍术的亲缘关系。朝鲜苍术与北苍术在形态上非常相似，仅叶片的分裂程度略有不同[1]。已有文献显示二者有较近的亲缘关系：Shiba等[10]研究表明用ITS序列无法对其进行区分；葛燕芬[11]对二者trnL-F序列进行测定及比较分析，结果表明北苍术与朝鲜苍术遗传关系较近。本实验中北苍术与朝鲜苍术聚为一类，与前人研究结果一致，均表明北苍术与朝鲜苍术亲缘关系相近。

白术与关苍术的亲缘关系。关苍术在日本作为白术药用，在韩国和朝鲜既作白术又作苍术。国内学者对此进行研究，发现关苍术在化学成分方面更接近白术：潘希陵[12]等对术类药材的挥发油成分进行分析，结果表明关苍术与白术聚为一类后再与茅苍术聚类；陈彦[13]应用高分辨气相色谱-模糊聚类分析法对苍术属药材进行色谱分析，研究结果也显示白术和关苍术具有较近的亲缘关系。本实验采用HPLC对苍术属植物的水溶性成分进行研究，结果显示关苍术与白术聚为一类，亲缘关系相近。

鄂西苍术与苍术属其它植物的亲缘关系。在形态学上，鄂西苍术与其他类群均有显著差异：根状茎不发达，成熟植株具有基生叶。马起凤[14]等对鄂西苍术化学成分进行研究，认为鄂西苍术是苍术属内较原始种，其他各种由其分化而来。本文研究表明，鄂西苍术单独聚为一类，表现了与其它苍术属植物较远的亲缘关系。这与邹小兴[9]对苍术属植物ITS和叶绿体基因间隔区的序列进行研究，认为鄂西苍术与属内其余植物亲缘关系较远的观点也一致。

本文采用高效液相色谱法建立不同产地苍术属植物水提物不同极性部位的指纹图谱，并进行综合聚类分析，研究苍术属植物亲缘关系，结果与课题组前期以挥发油成分为指标的研究结果一致。综合分析水溶性和挥发性化学成分的特征，能够更全面地从化学成分的角度为苍术属植物亲缘关系的研究提供理论依据。

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[7] 郭兰萍,黄璐琦,王敏,等.南北苍术的RAPD分析及其划分的初步探讨[J]. 中国中药杂志, 2001,26(3):156-158.

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[10] Shiba M,Kondo K,Miki E,et al.Identification of medicinal Atractylode s based on ITS sequences of nrDNA [J]. Biol Pharm Bull, 2006, 29(2): 315-320.

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[14] 马起凤,孟宪纾,周荣汉.中国苍术属化学成分与分类学的研究[J].沈阳药学院学报,1982,15:54-61.

Analysis on Chemical Genetic Relationship ofAtractylodesBased on HPLC Fingerprint Spectra of Water-soluble Components

Rui Mengjue1, Ouyang Zhen1,*, Peng Huasheng2,3, Zhao Ming1,Ye Dan, Shao Yang1, Jiang Shan1, Yang Shufang1, Yuan Ting1

(1.School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2.School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China；3.National Resource Centre of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

High-performance liquid chromatography was used to establish the chromatographic fingerprints of the different polar extracts obtained from Atractylodes. Traditional Chinese Medicine (TCM) chromatographic fingerprint similarity evaluation system and SPSS was used to analyze the similarity evaluation and cluster analysis, in order to probe the genetic relationship ofAtractylodes. Cluster analysis outcomes demonstrated that Atractylodes can be divided into four categories:Atractylodeslancea (Thunb.) DC. andAtractylodeslanceasubsp.luotianensisS.L. Hu et X.F. Feng;AtractylodesmacrocephalaKoidz. andAtractylodesjaponicaKoidz.; part ofAtractylodeslancea(Thunb.) DC. andAtractylodescoreana(Nakai) Kitam. andAtractylodeschinensis(DC.) Koidz;Atractylodescarlinoides(Hand.-Mazz.) Kitam.The result obtained from the cluster analysis is similar to the one obtained when volatile oil components are used as indicator. Establishing the chromatographic fingerprints of the water-soluble components fromAtractylodesprovided reliable and solid evidence forAtractylodesclassification and the elucidation of the genetic relationship ofAtractylodes.

Atractylodes; genetic relationship; HPLC; fingerprint spectra; cluster analysis

2014-11-21

国家自然基金项目(81072985/H2801)；江苏大学第十三批学生科研立项一般项目(13A156)。

芮梦珏，女，硕士研究生。研究方向：中药及其制剂质量控制研究。 E-mail:15862996627@163.com

*通讯作者：欧阳臻，教授，博士生导师。研究方向：中药活性成分研究及新药开发。E-mail: zhenouyang@ujs.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.03.001

R284

A

1006-9690(2015)03-0001-06