参附芎泽方对心衰大鼠血流动力学及心肌纤维化的作用*

韩 曼 马 莉 王 菲 于远望

陕西中医药大学基础医学院(咸阳712046)

参附芎泽方对心衰大鼠血流动力学及心肌纤维化的作用*

韩 曼 马 莉 王 菲 于远望△

陕西中医药大学基础医学院(咸阳712046)

目的：观察参附芎泽方对冠脉结扎所致心衰大鼠血流动力学及心肌纤维化的干预作用并探讨其相关机制。方法：SD大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、方药组。模型组、方药组结扎冠状动脉左前降支，假手术组只穿线不结扎。方药组每次经口灌服参附芎泽浓缩液；假手术组、模型组灌服等剂量生理盐水。各组干预8周后采用血流动力学检测评价心功能，Masson染色观察心肌纤维化程度，Western blotting检测心肌TGF-β1表达的变化。结果：与模型组相比，方药组左室舒张末压(LVEDP)显著降低，左室收缩压(LVSP)、左室内压上升和下降的最大速率(±dp/dtmax)明显升高；同时，方药组可使心衰大鼠心肌胶原纤维的沉积减少，心肌TGF-β1的表达降低。结论：参附芎泽方可改善冠脉结扎所致心衰大鼠的心功能，抑制心肌纤维化，其机制可能与降低心肌TGF-β1表达有关。

心力衰竭(Heart failure, HF)是各种心血管疾病终末阶段的共同表现，严重威胁着人类的身体健康和生命安全[1]。对HF发生机制的探索发现，心肌重塑是HF发生发展的基本机制，而心肌纤维化是心肌重塑的关键病理特征和重要形成原因。发生纤维化的心肌变得僵硬，心肌收缩与舒张功能障碍，心功能逐步减退，故心肌纤维化是心功能由代偿期向失代偿期转化的关键[2]。本文探讨参附芎泽方对冠状动脉结扎后心衰大鼠血流动力学与心肌纤维化的作用，以期为心梗后的心肌纤维化干预开辟新的途径。

1 实验材料 1.1实验动物 实验选用健康、雄性Sprgue-Dawley大鼠(260～290g)40只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供(动物合格证号：SCXK(陕)2012-003)。动物在标准环境下饲养，12h昼夜循环光照，自由饮水摄食。

1.2 主要药品与试剂 戊巴比妥钠购自Sigma；Western blotting相关试剂购自Amresco；兔抗TGF-β1多克隆抗体购自Abcam；肝素钠注射液(天津生物化学制药有限公司，产品批号：20111103)；中药材购于陕西中医药大学附属医院，参附芎泽方药由人参、黄芪、附子、川芎、丹参、泽泻六味中药构成。将中药制成煎煮液，生药含量为2g/mL。

1.3 实验仪器 BL-420A生物机能实验系统(成都泰盟生物科技有限公司)；HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟软件有限公司)。

2 实验方法 2.1 心衰模型制备 实验动物称重后以2%戊巴比妥钠(50～55 mg/kg)腹腔麻醉，仰卧位固定于自制手术台上，对文献介绍的冠状动脉结扎法[3]进行改良。首先采用无创性气管插管行人工呼吸；其次手术区备皮，碘伏消毒，沿左侧第3～4肋间隙做一约1～1.5 cm纵行切口，依次分离皮肤、筋膜、肋间肌，大鼠扩胸器撑开肋间肌暴露心脏，用脱脂棉小心撕开心包膜挤出心脏，一次性缝合针快速从心尖处穿过(切勿穿透心肌)，左手持线将心脏轻轻拉出胸腔，心脏搏动减缓，右手持持针器将另一一次性缝合针从左心耳下缘中点处进针，深度约0.15 cm，在肺动脉圆锥底部靠近冠状静脉的部位出针，迅速结扎(假手术组只穿线不结扎)，结扎后左室壁颜色较周围变浅，同时心电图ST段抬高，证明结扎成功。取出心尖的一次性缝合线，将心脏送回胸腔，清除胸腔内积血，排出胸腔内气体，连续缝合肋间肌、缝皮并对切口消毒。术后单笼喂养，青霉素20万U腹腔注射，连续3d，预防感染。

2.2 动物分组及给药方法 实验动物随机分为2组，假手术组(10只)和冠脉结扎组(30只)，假手术组术中死亡2只，冠脉结扎组术中死亡8只，术后死亡2只。冠脉结扎组术后8周，大鼠随机分为模型组(10只)、方药组(10只)。方药组每次经口灌服参附芎泽浓缩液2 mL，总药量相当于成人给药剂量的20倍；假手术组、模型组灌服等剂量生理盐水，各组干预均为8周。

2.3 血流动力学指标的测定 各组大鼠灌胃8周，于末次进食24h后，称重，2%戊巴比妥钠(50～55 mg/kg)腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，将充满肝素生理盐水的PE50导管，一端连接生物信号采集处理系统，一端沿右侧颈总动脉插入左心室腔内，待压力曲线稳定后，记录5 min血流动力学相关指标：心率(Heart rate, HR)、平均动脉压(Mean arterial pressure, MAP)、左室收缩压(Left ventricular systolic pressure, LVSP)、左室舒张压末压(Left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)及左室内压上升和下降最大速率(Left ventricular pressure maximum rising and falling rates, ±dp/dtmax)。

2.4 Masson染色观察心肌纤维化的程度 血流动力学指标检测后，处死大鼠，取出心脏，生理盐水冲洗,滤纸吸干，剪取左心室，部分置液氮转-80 ℃冰箱贮存，备检测Western blotting；部分置于10%甲醛固定48 h后，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片机切片，行Masson三色染色(心肌纤维胞质呈红色、胞核深蓝色，胶原纤维蓝色)，显微镜下观察拍照，并测定胶原纤维的容积比。

2.5 Western blotting法检测心肌TGF-β1蛋白表达的变化 将贮存于-80℃冰箱中的心肌组织每个样本取100 mg，裂解提取总蛋白。10% SDS-PAGE分离蛋白，300 mA转膜2 h，将蛋白转至PVDF膜。1%牛血清白蛋白封闭1 h，滴加Ⅰ抗(anti-TGF-β1)后，4℃过夜。将膜放入密封袋中加Ⅱ抗，室温摇床上轻摇1 h，化学发光试剂放射自显影。

2.6 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准误表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。

3 结 果 3.1 血流动力学的改变 各组大鼠HR、MAP无显著性差异(P>0.05)。与假手术组相比，模型组大鼠LVSP、±dp/dtmax显著降低(P<0.05)，LVEDP则明显升高(P<0.01)；与模型组相比，方药组大鼠 LVSP、±dp/dtmax显著升高(P<0.05)，LVEDP则有所降低(P<0.01)，详见表1。

表1 各组大鼠血流动力学比较

注：与假手术组相比△P<0.05，◇P<0.01；与模型组相比▲P<0.05，◆P<0.01

3.2 心肌纤维化的改变 如图1所示，假手术组大鼠心肌细胞间和血管周围有少量的胶原纤维；模型组大鼠心肌细胞间和血管周围可见分布弥散的片状或小灶状胶原纤维，其含量与假手术组相比显著增加(P<0.01)；方药组大鼠心肌胶原纤维含量较模型组明显减少(P<0．05)，详见表2。这一结果提示: 参附芎泽方能抑制心衰大鼠心肌胶原的沉积。

图1 Masson染色检测各组大鼠心肌纤维化变化(400×)

组 别胶原纤维容积比假手术组12.34±1.67模型组 48.72±2.55△方药组 23.63±0.45▲

注：与假手术组相比，△P<0.01；与模型组相比，▲P<0.05

3.3 心室肌TGF-β1蛋白表达的变化 Western blotting法结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠TGF-β1表达显著增多(P<0.01)，提示心肌中有细胞因子的浸润；与模型组大鼠相比，方药组大鼠TGF-β1表达明显降低(P<0.05)，表明参附芎泽方能抑制心衰大鼠心肌中细胞因子TGF-β1的浸润，结果如图2与表3所示。

图2 Western blotting 检测各组大鼠心肌组织中

组别心肌组织TGF-β1的表达(相对于GAPDH)假手术组0.23±0.17模型组 0.79±0.22△方药组 0.40±0.12▲

注：与假手术组相比，△P<0.01；与模型组相比，▲P<0.05

4 讨 论 各种心血管疾病发展的终末期均可引起HF，对人类的健康造成了严重的威胁。冠脉结扎术建立的心梗后HF是研究HF常用的动物模型，该模型能够很好的模拟心梗后心肌肥大、心肌胶原沉积，并逐渐演变到HF的全部病理过程，模型呈现的HF和神经内分泌激活方式与人类心衰过程相似[3]。以往研究表明，冠状动脉左前降支结扎4周后即可发生心室重构，8～12周可发展成HF[4]。本实验通过直接测定大鼠血流动力学指标发现：冠脉结扎8周后，反应左心室收缩功能的指标LVSP、±dp/dtmax比正常对照组有所下降，而反映左心室舒张功能的指标LVEDP比正常对照组显著增加，提示冠状动脉左前降支结扎8周后，大鼠心脏的收缩与舒张功能均严重受损，达到HF的标准。

现代医学认为，HF发生发展的基本机制是心肌重塑，心肌由三个密不可分的成分(心肌细胞、细胞外基质、毛细血管微循环)构成，这种构成为HF提供了心肌重塑的靶点。其中，细胞外基质主要由Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维组成，对心脏起到支持和保护作用，无论何种原因(包括心梗)引起心肌受损，只要病变持续，终将导致Ⅰ型、Ⅲ型胶原沉积增多、比例失调、排列紊乱，即，心肌纤维化[5]。发生纤维化的心肌变得僵硬，扩张性下降，心肌收缩障碍，使得心脏功能逐步减退。本研究结果显示，冠脉结扎后心衰大鼠心肌胶原纤维的沉积增加，心肌纤维化显著，经方药干预后，心衰大鼠心肌胶原纤维的沉积显著减少，心肌纤维化的程度明显降低。血流动力学检测结果表明，冠脉结扎后心衰大鼠心功能降低，而经方药干预的大鼠心功能各项指标均有改善，这与两组大鼠心肌纤维化的结果一致。

TGF-β1是重要的促纤维化生长因子，也是导致心肌纤维化诸多因素中最后的共同中介物之一，已被公认是器官纤维化的治疗靶标[5-6]。研究表明：TGF-β1在各种原因引起的心肌纤维化中均有较高表达。在动物模型及患有心脏疾病的病患的心肌组织中都发现了心肌纤维化以及TGF-β1的过表达。Brook等发现TGF-β1杂合子小鼠比野型对照组小鼠心肌纤维化明显减少，心功能明显增加。Kuwahara等也发现阻滞TGF-β1可对大鼠心肌纤维化起到治疗作用。本研究中冠脉结扎后心衰大鼠TGF-β1的表达增多，经方药干预后心衰大鼠心肌TGF-β1的表达明显降低，这与两组大鼠心肌纤维化的程度相一致，提示参附芎泽方通过降低心衰大鼠心肌TGF-β1的表达抑制心肌纤维化，从而改善心功能。

参附芎泽方由党参、黄芪、丹参、附子、川芎、泽泻组成，方中党参和黄芪具有益气强心作用，且可改善心肌能量代谢[7-8]，另外,黄芪还有心肌保护作用；丹参和川芎具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦和滋补之功效作用[9]，国内学者研究发现丹参可抑制心肌成纤维细胞的增殖和胶原的合成，具有良好的拮抗心肌重塑的作用[10]，川芎中的川芎嗪具有钙离子拮抗作用，使血管舒张，降低心室后负荷，减轻心室重塑[11]；附子和泽泻具有温阳利水作用，减轻心室前负荷，改善心功能[12]。本研究结果提示，参附芎泽方对心衰大鼠心功能具有显著改善作用，其机制之一可能通过减少心肌TGF-β1的表达，从而抑制心肌纤维化实现的。

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(收稿2015-03-22；修回2015-04-15)

Effects of Shenfu Xiongze Decoction on Hemodynamics and Myocardiac Fibrosis in Heart Failure Rats

Han Man Ma Li Wang Fei et al

School of Basic Medicine，Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Obiective：To explore therapeutic effects of the Shenfu Xiongze Decoction on hemodynamics and myocardiac fibrosis in rats with heart failure (HF) induced coronary artery ligature. Methods: SD rats were randomly divided into three groups: sham operated group, model group and herbs group. The rats of modle group and herbs group received the ligation of left anterior descending artery, while the rats of sham group were accepted sham operation (without ligation of left anterior descending artery, the rest of the operation was the same as the model). The herbs group were fed with Shenfu Xiongze Decoction, sham group and model group were fed with saline. After 8 weeks, hemodynamic evaluation were conducted to determine the cardiac functions．Masson staining was used to observe the degree of myocardial fibrosis．The protein level of transforming growth factors-β1(TGF-β1) was detected by Western blotting. Results: Compared with model group, left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) decreased in the herbs group. At the same time, left ventricular systolic pressure (LVSP) and left ventricular pressure maximum rising and falling rates (±dp/dtmax) increased significantly in the herbs group. Herbs reduced the degree of myocardial collagen deposition (P<0.01) and decreased the expression of TGF-β1. Conclusion: Shenfu Xiongze Decoction improves heart functions and inhibits myocardial fibrosis in rats with HF induced by coronary artery ligature by decreasing TGF-β1protein expression level．

Heart failure/traditional Chinese medicine therapy Hemodynamics Animal experimentation Rats @Shenfu Xiongze decoction

* 陕西省中医药管理局中医药科研项目(13-LC066；13LC061)

心力衰竭/中医药疗法 血流动力学 动物实验 大鼠 @参附芎泽方

R541.6

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.051

△通讯作者