抗癌方有效部位群对荷瘤小鼠的抑瘤作用*

2015-03-22范引科姜姗姗谢人明

陕西中医 2015年11期

关键词：荷瘤抗癌肝癌

李雅范引科姜姗姗杨洁赵岗谢人明

陕西省肿瘤医院 (西安 710061)

抗癌方有效部位群对荷瘤小鼠的抑瘤作用*

李雅范引科△姜姗姗△杨洁△赵岗△谢人明△

陕西省肿瘤医院 (西安 710061)

目的：观察抗癌方有效部位群对小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌瘤体的抑制作用及肿瘤坏死因子(TNF)活性的影响。方法：通过小鼠移植性S180肉瘤生长试验、小鼠移植性H22肝癌瘤株生长试验及采用MTT法测定肿瘤坏死因子(TNF)活性试验，观察抗癌方对S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠的瘤体重量、抑瘤率及肿瘤坏死因子(TNF)活性的影响。结果：抗癌方大剂量组(1.00g/kg)、中剂量组(0.50g/kg)、小剂量组(0.25g/kg)能够明显抑制小鼠移植性S180、H22荷瘤小鼠瘤体的生长，减少瘤体重量、增强抑瘤率(P<0.01，P<0.05)；抗癌方大剂量组(1.00g/kg)、中剂量组(0.50g/kg) 明显升高TNF活性(P<0.05或0.01)。结论：抗癌方对小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌具有显著的抑瘤作用，增强肿瘤坏死因子(TNF)活性是其可能作用机制之一。

恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一，我国已进入老龄化社会，肿瘤发病率及死亡率呈高发趋势，从天然植物中寻找低毒、高效的抗癌活性成分药物仍是近年来国内外学者热衷的研究课题。

抗癌方有效部位群(简称抗癌方)出自我院名老中医验方，由蟾皮、莪术、延胡索等诸药配伍组合而成，具有解毒散结，活血祛瘀，行气止痛之功效。临床观察证实用于肝癌、胃癌等多种肿瘤及癌痛的治疗具有较好效果。我们通过抑瘤实验等系列全面探讨抗癌方抗肿瘤作用与机理，为阐明其科学内涵，进一步临床应用提供充分的科学依据。

1 实验材料 1.1 受试药物抗癌方，由蟾皮、莪术、延胡索等诸药经提取得到有效部位配伍组合而成,含蟾毒配基类化合物，莪术挥发油类，异喹啉类生物碱等多种成分，具有解毒散结，活血祛瘀，行气止痛之功效。1g药粉相当3.02 g原生药。

1.2 阳性药物注射用环磷酰胺，批准文号(国药准字号H14023686)，山西普德药业股份有限公司生产，规格：0.2g。

1.3 瘤株小鼠S180肉瘤细胞株，肝癌H22细胞株，由第四军医大学实验动物中心提供。

1.4 实验动物 KM小鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，体重18～22g，许可证号：SCXK(陕)2010-001。

1.5 试剂及仪器氯化钠注射液:西安京西双鹤药业有限公司生产；标准胎牛血清： TBD31HB， 100mL，Gibco公司；胰蛋白酶消化液：西安舟鼎国公司；二甲基亚砜(DMSO)：美国Solarbio公司；刀豆蛋白A(ConA)：西安舟鼎国公司；RPMI-1640 ：Gbico公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)：西安舟鼎国公司； 96孔培养板:美国Corning公司；电子天平：型号：BS210S 北京赛多利斯天平厂；普通光学显微镜：olympus 生产；SW-CJ-2D型双人净化工作台，型号：NO.0904192，苏州净化设备有限公司生产；恒温培养箱：Heraeus ；酶标仪：BIO-RAD Model 680 serial NO.13628 Made in Japan。

2 实验方法 2.1抗癌方对小鼠移植性S180肉瘤生长的影响按文献方法[1-2]，取KM小鼠50只，体重18～22g，每次试验均采用单一性别，在洁净工作台内制备瘤细胞悬液(1×107个/mL)，每只小鼠无菌条件下腋下接种瘤细胞悬液0.2mL，计瘤细胞数约为2×106个。24h后按体重随机分为5组，分别为荷瘤对照组(常水,10mL/kg)、阳性对照组(环磷酰胺,20mg/kg)和抗癌方大剂量组(1.00g/kg)、中剂量组(0.50g/kg)、小剂量组(0.25g/kg)。各组灌胃体积均为10mL/kg，1d1次，连续给药10d。末次给药后次日，称体重后处死小鼠，剖取瘤块，计算体重和抑瘤率,试验重复2次, 统计学处理t检验。

2.2 抗癌方对小鼠H22肝癌瘤株生长及肿瘤坏死因子(TNF)活性的影响 2.2.1 按文献方法[1-2]，KM小鼠50只，雄性，体重 18～22g。在洁净工作台内无菌操作制备小鼠肝癌瘤细胞悬液(1×107个/mL)，每只小鼠无菌条件下右前肢腋部皮下接种肝癌细胞悬液0.2mL，计瘤细胞数约为2×106个。24h后按体重随机分为五组: 荷瘤对照组(常水,10mL/kg)、阳性对照组(环磷酰胺,20mg/kg)和抗癌方大剂量组(1.00g/kg)、中剂量组(0.50g/kg)、小剂量组(0.25g/kg)。各组灌胃体积均为10mL/kg，1d1次，连续给药10d。末次给药后1.5h,称小鼠体重后处死，无菌制备脾细胞悬液[3]；解剖取瘤称重，按公式计算肿瘤抑瘤率，统计学处理t检验。

2.2.2 TNF的诱生活性测定[3]:将制备的小鼠脾细胞悬液用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×106/mL，接种于24孔培养板，每孔500μL，每孔再加终浓度为5μg/mL的ConA，500μL/孔，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养48 h后，取上清液备用。

采用MTT法测定TNF的活性[3]将生长良好的L929细胞消化液消化配制成4×105/mL，接种于96孔培养板100μL/孔，将待测样品也加入培养板100μL/孔，每只待测样品均设5孔，同时设靶细胞对照，加入靶细胞和RPMI-1640各100μL。37℃ 5%CO2培养箱内培养48 h后，轻轻吸去上清液100μL，加入MTT(1mg/mL)试液100μL，37℃ 5%CO2培养箱内培养2 h后，吸弃上清液，每孔加DMSO100μL，作用30min，用酶标测定仪测570nm处的吸收度,统计学处理采用t检验。

3 实验结果 3.1 抗癌方对小鼠移植性S180肉瘤生长的影响由表1、表2结果可见：抗癌方大剂量组(1.00g/kg)、中剂量组(0.50g/kg)、小剂量组(0.25g/kg)、阳性对照组(环磷酰胺,20mg/kg)能明显抑制小鼠移植性S180瘤体的生长(P<0.01,P<0.05)，且呈一定剂量关系。

表1 抗癌方对小鼠移植性S180肉瘤生长的影响(♂)

注：与荷瘤对照组相比,△P<0.05；▲P<0.01

表2 抗癌方对小鼠移植性S180肉瘤生长的影响(♀)

注：与荷瘤对照组比较,△P<0.05；▲P<0.01

3.2抗癌方对小鼠H22肝癌瘤体生长的影响由表3结果可见：抗癌方大剂量组(1.00g/kg)、中剂量组(0.50g/kg)、小剂量组(0.25g/kg)、阳性对照组(环磷酰胺,20mg/kg)明显抑制小鼠移植性H22肝癌瘤体的生长(P<0.01)，抑瘤率分别达到57.20%、46.51%、36.74%、78.60%，试验呈现出良好的量效关系。

表3 抗癌方对小鼠移植性肝癌生长的影响

注：与荷瘤对照组相比: △P<0.05；▲P<0.01

3.3 抗癌方对小鼠H22肝癌瘤株TNF(肿瘤坏死因子)活性测定由表4结果可见：抗癌方大剂量组(1.00g/kg)、中剂量组(0.50g/kg)与荷瘤对照组比较TNF活性明显升高 (P<0.05或0.01)，环磷酰胺组与荷瘤对照组比较，具有降低TNF活性的作用(P<0.01)。

表4 抗癌方对小鼠H22肝癌瘤株

注：与荷瘤对照组相比: △P<0.05 ；▲P<0.01

4 讨论恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一，肿瘤发病率及死亡率呈高发趋势。2l世纪初，我国每年死于癌症的人数已高达150万[4]。

近年来的研究表明，蟾皮抗肿瘤作用主要是蟾毒配基类，对白血病细胞、实体瘤细胞都有生长抑制和诱导分化作用，证实它可以诱导肿瘤细胞的分化和凋亡还能抑制肿瘤血管和血管内皮增生[5]。国内学者已从不同角度和层次证明了莪术及其抗肿瘤成分莪术醇、榄香烯、莪术酮等的抗肿瘤作用[6]；延胡索的主要成分中延胡索乙素镇痛作用最强,科学实验表明延胡索具有很好的镇痛、镇静和催眠的药理作用[7]。TNF是迄今发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物学活性因子之一，能选择性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖，而不影响正常细胞的生长、分化和代谢功能，且能协同其它生物学因子功能，扩大抗肿瘤谱[3]。

本研究结果表明抗癌方对小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌具有显著的抑瘤作用，能够增强肿瘤坏死因子(TNF)活性。实验结果提示抗癌方既具有抑制肿瘤生长的作用，又具有调节抗肿瘤细胞活性因子TNF增强对肿瘤细胞的杀伤作用。说明抗癌方可诱导机体产生TNF,通过TNF直接杀伤肿瘤细胞是其抗肿瘤作用机制之一。

抗癌方中多种中药来源的化学成分不仅对肿瘤细胞具有直接的细胞毒杀伤作用,而且能够从不同途径提高肿瘤患者的免疫功能,这将为我们找到疗效确切、毒副作用小的抗肿瘤药物而奠定基础[8]。我们将继续通过抗肿瘤免疫实验等进一步全面探讨抗癌方抗肿瘤作用与机理，为临床应用提供充分的科学依据。

[1] 魏伟.药理实验方法学[M].第四版.北京：人民卫生出版社，2010： 1072-1074.

[2] 陈奇.中药药理研究方法学[M].第三版.北京：人民卫生出版社，2011: 706-712.

[3] (美)拉波萨塔(Laposata；M.)原著.高德禄,张世俊,主译.临床免疫学方法[M]. 北京：人民军医出版社,2012:512-515,638-651.

[4] 吴菲,林国桢,张晋昕.我国恶性肿瘤发病现状及趋势[J].中国肿瘤,2012,21(2):81-83.

[5] 王晓东,严子平,张莉,等.蟾皮提取分离方法及有效成分的研究进展[J]. 武警医学院学报,2011,24(12):1757-1767.

[6] 徐燕萍,胡小庆,湛学军.莪术对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].山东医药,2012,52(4):51-53.

[7] 吕子明,孙武兴,段绪红,等. 延胡索化学成分研究 [J].中国中药杂志,2012,32(2):1757-1767.

[8] 白云,刘萍,贾博宇.中药抗肿瘤作用的研究进展[J].中国药师,2014,17(8):1406-1409.

(收稿2015-06-05；修回2015-07-19)

*陕西省中医药管理局课题(2012-JC18)