芪连扶正胶囊对TGF-β介导EMT作用的影响

李秀荣 齐元富 李慧杰

(山东中医药大学附属医院，济南，250014)

芪连扶正胶囊对TGF-β介导EMT作用的影响

李秀荣 齐元富 李慧杰

(山东中医药大学附属医院，济南，250014)

目的：观察芪连扶正胶囊含药血清对TGF-β及EMT相关分子在肺癌A549细胞中表达的影响，探讨相关机制。方法：体外培养肺癌A549细胞，制备芪连扶正胶囊含药血清，分组干预，采用RT-PCR检测TGF-β1mRNA表达，IC检测E-cad与N-cad表达。结果：对照组、芪连扶正低剂量、中剂量、高剂量组、化疗组及联合组的TGF-β1 mRNA相对表达量依次为(31.11±1.58)%、(29.53±1.50)%、(27.28±1.75)%、(25.23±1.38)%、(23.03±1.59)%、(20.72±1.38)%；各组E-cad、N-cad均有不同程度阳性表达，除芪连扶正胶囊低剂量组外，各药组E-cad阳性率均高于对照组、N-cad则相反(P<0.05或P<0.01)；与化疗组相比，联合组及芪连扶正胶囊各组亦有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：芪连扶正胶囊可通过逆转TGF-β介导的EMT作用防止肿瘤转移。

芪连扶正胶囊；TGF-β；EMT；抗肿瘤转移

上皮-间充质转化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转化的现象，EMT是上皮细胞获得迁移能力的有效方式，也是上皮细胞癌浸润转移的一个重要途径[1]。TGF-β在体内和体外培养的大多数上皮细胞、上皮来源的肿瘤细胞中均具有诱导EMT的作用，是目前研究最广泛的EMT诱导因子[2]。大量实验与临床研究证实中医药具有抑制肿瘤转移作用，笔者选用具有解毒化痰、消积散结、扶正抗癌之效的院内制剂芪连扶正胶囊为研究对象，观察其对TGF-β及EMT相关分子在肺癌A549细胞中表达的影响，以期为防治肺癌复发转移筛选有效中成药。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物 高转移人肺腺癌细胞系A549细胞株，购自山东省医学科学院细胞室。SPF级SD雄性大鼠，购自山东中医药大学实验动物中心，质量合格证编号为SCXK(鲁)20110003。

1.2 药品试剂 芪连扶正胶囊(山东中医药大学附属医院药剂科，批号：Z0120030239)，顺铂(DDP，齐鲁制药有限公司，批号：207062DC)。胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，改良型RPMI-1640培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，兔抗人E-cad多克隆抗体(编号：BA0475)、兔抗人N-cad多克隆抗体(编号：BA0673)、浓缩型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，总RNA提取试剂盒、SuperRT二步法RT-PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)。TGF-β1与β-actin引物：由上海生工生物技术有限公司合成，TGF-β1上游5’-CAGACTCTAGAGACTGTCAG-3’，下游5’-GTCACCAGAGAAAGAGGAC-3’，分子量：384bp；β-actin上游5’-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3’，下游5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’，分子量：302 bp。

1.3 主要仪器 超净工作台(美国Thermo Forma公司)，CO2培养箱、鼓风干燥箱、超纯水系统(德国Heraeus公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，电热压力蒸汽消毒器(山东安得医疗科技有限公司)，梯度PCR仪、电泳仪(德国Biometro公司)，PCR仪(英国Thermo Hybaid公司)，凝胶成像分析系统(美国Alpha公司)。

1.4 芪连扶正胶囊含药血清制备 购买体200 g左右、♂SD大鼠25只，适应性喂养5 d；分为芪连扶正胶囊组与空白对照组，前者予以芪连扶正胶囊溶液灌胃，后者给予等量生理盐水，1次/d；给药第7 d末次灌药前12 h禁食，末次给药后1 h戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，离心，取上清，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 实验分组 共分6组：对照组(10%胎牛血清)，芪连扶正胶囊低剂量组(5%含药血清)，芪连扶正胶囊中剂量组(10%含药血清)，芪连扶正胶囊高剂量组(20%含药血清)，顺铂组(终浓度为2 μg/mL)，联合组(10%含药血清+顺铂)。

1.6 PT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达 常规培养细胞，制备细胞悬液，平均分瓶，待细胞长满时按实验分组加药干预，48 h时后按试剂盒说明书逐步提取总RNA，紫外分光光度仪测定RNA样品纯度，各组样品吸光度比值均在1.93～1.96之间，可进行后续实验。按试剂盒说明书逐步合成cDNA、扩增PCR，制胶、上样，跑电泳约30 min，完毕后将胶板至0.5 μg/mL EB溶液中室温染色20 min，凝胶成像分析系统观察拍照，分析各目的条带和内参的灰度值(IDV)，计算相对表达量(RATIO)，RATIO=目的条带IDV/内参IDV[3]。

1.7 IC检测E-cad与N-cad表达 常规培养细胞，制备细胞悬液，计数并调整密度以2×105为宜；将细胞悬液垂直加于到经预处理有盖玻片的六孔板内，2 mL/孔，继续培养；待细胞爬好片后，按实验分组加药，48 h后弃液，95%乙醇固定，5%Trion X-100室温孵育，3%H2O2室温孵育，正常山羊封闭血清封闭，一抗稀释液4 ℃孵育过夜，二抗稀释液37 ℃孵育30 min，SABC 37 ℃孵育30 min，DAB显色5～30 min，以均匀黄染为宜，苏木素复染，盐酸乙醇脱色，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中心树胶封片，观察拍照，高清晰度彩色病理图文分析系统定量分析。

1.8 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件对实验数据单因素方差分析，检验标准以P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达 对照组、芪连扶正低剂量、中剂量、高剂量组、化疗组及联合组的TGF-β1 mRNA相对表达量依次为(31.11±1.58)%、(29.53±1.50)%、(27.28±1.75)%、(25.23±1.38)%、(23.03±1.59)%、(20.72±1.38)%；与对照组相比，各药组TGF-β1mRNA的相对表达量均低于对照组，但芪连扶正胶囊低剂量组与之无统计学意义(P>0.05)，余药组均有统计学意义(P<0.01)；与化疗组相比，芪连扶正胶囊各组TGF-β1mRNA的相对表达量均高于化疗组，比较均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，而联合组TGF-β1mRNA的相对表达量低于化疗组，比较亦有统计学意义(P<0.05)。

2.2 免疫组化检测E-cad与N-cad表达 胞浆、胞核、胞膜为棕黄色颗粒者即阳性细胞，各组E-cad与N-cad均有不同程度阳性表达。与对照组相比，各药组E-cad阳性率均高于对照组、N-cad则相反，其中芪连扶正胶囊低剂量组无统计学意义(P>0.05)，余药组均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与化疗组相比，芪连扶正胶囊各组E-cad阳性率均低于化疗组、N-cad高于化疗组，比较均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；而联合组E-cad高于化疗组、N-cad低于化疗组，比较亦有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；见表1。

表1 EMT相关因子蛋白表达情况

注：单因素方差分析，与化疗组比较,*P<0.05，**P<0.01；与对照组比较,△P<0.05、△△P<0.01。

3 讨论

上皮间充质转化是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转化的现象，存在于多种慢性疾病的发病过程及肿瘤浸润转移过程中。E-钙黏着蛋白(E-cadherin)的减少或丢失、分子Zonula occludens-1(ZO-1)的丢失和重定位、上调某些蛋白质的表达以及EMT与胞外基质的关系是EMT的主要特征[4]。在EMT过程中伴有多个细胞分子标志改变，其中E-cadherin的减少或丢失是EMT最重要的标志性变化，同时也是促进肿瘤转移的重要表现，另一种钙黏蛋白，N-钙黏蛋白(N-cadherin)在EMT发生后表达增加，具有促进肿瘤细胞运动和转移的作用[5]。EMT可被多种信号分子所诱导，其中TGF-β是其诱导发生的关键因子，研究较为广泛。TGF-β参与肿瘤EMT过程的主要机制是通过Smad途径和非Smad途径完成的[6-7]。首先，TGF-β与肿瘤细胞膜上的TβRⅡ结合，通过TβRⅡ激酶使TβRⅠ磷酸化，进一步激活下游的Smad2/3，磷酸化的Smad2/3再与胞内的Smad4结合形成三聚体，进入细胞核与DNA结合而发生相互作用，促使EMT形成[8]。TGF-β还可通过非Smad依赖途径对肿瘤EMT进行调节，如丝裂原活化的蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)途径，TGF-β通过MAPK途径激活下游的细胞外调节蛋白激酶(Extracellular Regulated Protein Kinase,ERK)，从而诱导肿瘤EMT发生[9]。TGF-β/Smad通路与多条通路间进行“交谈”，与Wnt通路的“对话”可上调EMT诱导因子Snail和Twist，抑制E-cad表达，同时激活β-catenin/TCF/LEF复合物，间接导致vimentin等间质标志物的表达，共同协调完成对肿瘤EMT的调节[10]。鉴于EMT在肿瘤转移中的作用，其相关研究可深入了解EMT影响肿瘤的机制，还可促进EMT作为生物标记物与靶点治疗的研究[11]。

传统中医药在肿瘤防治中发挥着重要作用，研究发现一些中药的有效成分及复方有明显的抗肿瘤作用，具有良好的应用前景，而其中中西医结合治疗肺癌进展较快，尤其体现在中药对肺癌放化疗减毒和增效及手术后防复发转移方面的研究方面[12]。芪连扶正胶囊由生黄芪、连翘、莪术、清半夏、天南星、白花蛇舌草、仙鹤草、全蝎、蜈蚣、壁虎、女贞子十一味中药组成，方中黄芪乃补气药之长，可补中益气，营运中州，且生用力专，取其益气托毒之功；连翘不仅能解疮毒，又能散气血凝聚、具有消痈散结之功，为疮家圣药；莪术有破血行气，消积止痛之效，为医家治积聚最药；清半夏、天南星、白花蛇舌草、仙鹤草、全蝎、蜈蚣、壁虎多具有解毒祛瘀散结之效；女贞子则补益肝肾、滋阴清热，反佐诸药伤阴之弊。芪连扶正胶囊纵观全方，药精力专，可针对肿瘤患者病机特点发挥解毒消积、扶正抗癌作用。且大量现代药理研究证实本胶囊所选药物可通过不同机制、不同程度的抑制肿瘤细胞、调节机体免疫力达到抗肿瘤作用，印证了芪连扶正胶囊组方的合理性与治疗恶性肿瘤的有效性[13]。近年来研究发现，EMT是肺癌发生侵袭转移的重要原因，TGF-β可以促使肺癌细胞中E-cad表达减少，细胞发生EMT，提高其侵袭和迁移能力[14]。本研究结果表明芪连扶正胶囊含药血清可上调E-cad表达、下调N-cad表达与TGF-β1mRNA表达，逆转TGF-β介导的EMT发生，发挥抗肿瘤转移作用，提示芪连扶正胶囊可作为防治肺癌转移的有效中成药。

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(2013-08-30收稿 责任编辑：徐颖)

Effect of Qilian Fuzheng Capsule on TGF-β-mediated EMT

Li Xiurong, Qi Yuanfu, Li Huijie

(TheAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTCM,Jinan250014，China)

Objective:To observe the effect of Qilian Fuzheng Capsule on expression of EMT(epithelial mesenchymal transition) and TGF-β in lung cancer A549 cells, and study its possible mechanism.Methods:A549 cells were cultured in vitro and group intervened, RT-PCR to detected the expression of TGF-β1mRNA, using Immunohistochemical to detected the expression of E-cad and N-cad.Results:the TGF-β1 mRNA relative expression of the control group，Qilian Fuzheng Capsule low, medium and high dose groups, chemotherapy group and combined group were (31.11±1.58)%、(29.53±1.50)%、(27.28±1.75)%、(25.23±1.38)%、(23.03±1.59)%、(20.72±1.38)% respectively. Except the low-dose group, the expression of E-cad and N-cad in other drug groups were all significantly different compared with the control group; the combined group and all Qilian Fuzheng Capsule groups were significantly different compared with the chemotherapy group.Conclusion:Qilian Fuzheng Capsule can reverse the TGF-β-mediated EMT therefore play an anti-tumor effect.

Qilian Fuzheng Capsule; TGF-β; EMT; Anti-metastatic

李秀荣(1963—)，女，汉族，山东济南人，医学博士，主任医师，博士研究生导师，山东中医药大学附属医院肿瘤科，从事中西医结合肿瘤防治研究

R285.6;R243

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.022