吉非替尼对哮喘小鼠模型气道上皮重塑抑制作用的研究*

第四军医大学西京医院呼吸与危重症医学科(西安710032) 宋 娇 马战平 刘大鹏 杨学敏 宋立强

吉非替尼对哮喘小鼠模型气道上皮重塑抑制作用的研究*

第四军医大学西京医院呼吸与危重症医学科(西安710032) 宋 娇△马战平#刘大鹏 杨学敏 宋立强▲

目的：观察选择性表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对哮喘小鼠气道上皮重塑的影响。方法：将BALB/c小鼠随机分为正常对照组、哮喘组、吉非替尼预防组(预防组)、吉非替尼治疗组(治疗组)。苏木精-伊红染色法、过碘酸-雪夫特殊染色法、原位末端转移酶标记法分别检测各组小鼠气道中炎症细胞浸润水平、杯状细胞数量及上皮细胞凋亡等指标,Western blot法检测各组小鼠肺组织中p-EGFR、EGFR蛋白含量的变化。结果：与正常对照组相比,哮喘组小鼠出现明显的气道柱状纤毛上皮损伤脱落、杯状细胞数量增加的病理变化,吉非替尼预防组与治疗组的上述病理改变程度有所改善,以预防组改善最为明显，各组差异均有统计学意义(P<0.05)。与哮喘组相比,预防组和治疗组肺组织中p-EGFR表达水平明显减少(P<0.05)。与哮喘组相比,预防组小鼠肺组织气道上皮细胞凋亡率显著升高(P<0.05),治疗组表现出凋亡细胞增多的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论：吉非替尼通过阻断EGFR信号传导通路，增加哮喘气道上皮新生细胞凋亡的数量，从而达到一定抑制气道上皮重塑的效果，为哮喘气道重塑的防治提供了新的思路。

气道上皮细胞是哮喘发病的始动部位之一，其结构重塑的主要特征是柱状纤毛上皮细胞数量减少、杯状细胞增生而比例显著增高,从而引发气道黏液高分泌及促进全层气道重塑的形成。上皮重塑的发生机制是气道慢性持续性炎症的反复损伤及组织异常修复,目前其防治已成为治疗哮喘的研究热点。上皮细胞表皮生长因子受体(EGFR)及下游信号转导通路在气道上皮组织损伤修复过程中发挥关键作用，近期研究发现哮喘气道上皮组织中EGFR的表达水平与组织损伤、病情严重程度相一致[1],提示阻断EGFR信号转导通路可能对哮喘上皮重塑及病情控制起到一定作用。吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制剂,可抑制肿瘤细胞增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡,现已广泛应用于非小细胞肺癌的临床治疗[2]。本实验拟通过给予哮喘小鼠模型吉非替尼预防和治疗性干预,观察哮喘小鼠气道上皮重塑的变化,并初步探讨其机制。

材料与方法

1 材 料 ①实验动物：清洁级雌性BALB/c小鼠40只，6～8周龄，体重19～25g，非含卵蛋白饲料喂养，饲养及实验环境温度21℃～25℃，湿度为45.5%～65.5%。由第四军医大学实验动物中心提供。②主要试剂：Schiff试剂、鸡卵清蛋白(OVA II级)购自Sigma公司,EGFR抗体、磷酸化EGFR抗体购自Cell signal technology公司,原位末端转移酶标记试剂盒(POD)、DAPI试剂购自Roche公司,总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒为碧云天公司产品,吉非替尼原料为AstraZeneca UK Limited公司提供。③主要仪器设备：雾化器(402C型,上海鱼跃公司)、雾化箱(自制)；生物图像分析系统(Image Pro Plus 6.0,美国Media Cybernetics公司)

2 方 法 ①动物分组及哮喘模型建立：参照文献[3]并做改良。实验小鼠按随机数字表法分为4组，每组10只：正常对照组、哮喘组、哮喘+吉非替尼预防组(预防组)、哮喘+吉非替尼治疗组(治疗组)。后3组小鼠在第0、7日给予0.5ml OVA/Al(OH)3溶液腹腔注射致敏，第14～20日每日雾化吸入OVA(2.3mg/m3，5h/d)激发；正常对照组给予生理盐水替代OVA腹腔注射及雾化吸入。预防组小鼠于第14～20日雾化吸入前12h按体重以50mg/kg剂量饲喂吉非替尼溶液(10mg/ml,溶于10%葡萄糖溶液),治疗组小鼠于第18～20日雾化吸入前12h给予吉非替尼口服(剂量同预防组),正常对照组和哮喘组小鼠于第14～20日雾化吸入前12h按体重以50mg/kg剂量饲喂10%葡萄糖溶液。②取材及标本制备：在末次激发24h后,腹腔注射10mg戊巴比妥钠麻醉后处死各组小鼠，充分暴露胸腔内容物，取左肺剪成厚约0.3cm小段，置4%多聚甲醛缓冲液浸泡24h后,常规脱水、石蜡包埋,制成约3μm厚度石蜡组织切片；右肺立即置于液氮中冷冻保存,待Western blot实验检测。③HE染色检测小鼠气道炎症水平：石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精水化后,行HE染色。于光镜下观察，每只小鼠随机选5张肺组织切片,每张切片以单盲法随机选取横断面较圆 (直径约100～200μm,管腔最短径/最长径≥0.6)的支气管5支进行观察并照相。按文献[4]评定支气管周围炎症细胞浸润程度：无炎症细胞(0分);少许炎症细胞(1分);较多分布不均匀的炎症细胞(2分);大量炎症细胞,分布较均匀,少见聚集成团(3分);大量炎症细胞聚集成团(4分)，取其平均值为统计数据。④PAS染色检测小鼠气道杯状细胞增生水平：石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精水化后,行过碘酸-雪夫染色。杯状细胞所含及分泌黏液以中性糖蛋白为主,呈紫红色。具体方法同HE染色,测量杯状细胞面积(Wag)和支气管基底膜周径(Pbm),计算Wag/Pbm值,取其平均值为统计数据。⑤Western blot技术检测肺组织EGFR、p-EGFR含量：取右肺下叶组织约100.0mg,首先利用蛋白提取试剂盒提取标本总蛋白并定量，进行电泳、切胶、电转膜，再进行一抗、二抗孵育，最后用荧光显色剂浸泡经过一抗和二抗孵育的膜,暗室曝光。以β-actin为内参对照,使用生物图像分析系统分别统计EGFR、p-EGFR计算条带灰度值,并计算p-EGFR/EGFR比值为统计数据。⑥原位末端转移酶标记法检测气道上皮细胞凋亡情况：石蜡切片常经脱蜡、梯度酒精水化后，TUNEL法检测小鼠气道杯状细胞凋亡情况。严格按说明书操作，预处理为20μg/ml蛋白酶K溶液37℃消化15min，1μg/ml DAPI复染细胞核，甘油封片。绿色荧光为凋亡阳性信号，蓝色荧光为DAPI复染信号,均表达于细胞核，绿色与蓝色荧光重合,判定为阳性凋亡杯状细胞。具体方法同HE染色实验。计数凋亡气道上皮细胞数为Acm,以支气管基底膜周径(Pbm)标准化凋亡细胞数量(Acm/Pbm,个/mm)，取其平均值为统计数据。

结 果

1 各组小鼠气道病理变化及组织炎症状况 见表1。正常对照组小鼠气道上皮组织切片镜下结构完整,假复层纤毛柱状上皮分布规整,黏膜下少量炎症细胞浸润。与正常对照组小鼠比较,哮喘组小鼠气道上皮结构破坏,柱状纤毛上皮细胞脱落,黏膜下大量炎症细胞浸润。与哮喘组小鼠比较,预防组、治疗组小鼠上皮细胞的病理改变减轻,炎症细胞浸润数量明显减少,尤以预防组改善最为明显。

2 各组小鼠中气道杯状细胞数量及增生水平 见表1。正常对照组小鼠气道上皮中杯状细胞的数量较少，呈现散在分布,内含少量着色的黏蛋白颗粒。与正常对照组比较,哮喘组小鼠气道杯状细胞数量显著增多,呈现簇状分布,内含大量着色的分泌颗粒,同时管腔中也可见黏蛋白颗粒。吉非替尼预防组、吉非替尼治疗组气道杯状细胞数量较哮喘组明显减少,以预防组最为明显。

表1 各组小鼠气道黏膜炎症水平及杯状细胞数量的比较

注：与正常对照组相比,*P<0.05；与哮喘组相比,△P<0.05；与预防组相比,▲P<0.05

3 各组小鼠中肺组织中p-EGFR、EGFR蛋白表达水平 见表2。与正常对照组比较，哮喘组小鼠肺组织中p-EGFR、EGFR条带灰度值明显增高,预防组、治疗组小鼠肺组织中p-EGFR条带灰度值明显减少,预防组减少最为明显。

表2 各组小鼠肺组织p-EGFR、EGFR蛋白 表达水平的比较

注：与正常对照组相比,*P<0.05；与哮喘组相比,△P<0.05；与预防组相比,▲P<0.05

4 各组小鼠中气道上皮细胞凋亡水平 哮喘组小鼠气道上皮Acm/Pbm为(15.44±3.456)明显高于正常组小鼠(5.22±1.324)(P<0.05)；与哮喘组相比，治疗组小鼠Acm/Pbm(17.92±3.987)无明显差异(P>0.05)，而预防组小鼠Acm/Pbm(25.54±8.232)明显增加(P<0.05)。

5 相关性分析 各组小鼠肺组织p-EGFR蛋白表达水平与气道杯状细胞的数量，呈现正相关关系(r2=0.59，P<0.05)，提示p-EGFR蛋白水平与杯状细胞数量即黏液高分泌症状的形成密切相关。

讨 论

哮喘急性发作及缓解患者均存在气道重塑病理改变，提示气道重塑与气道炎症是两个并行发展且互相影响的病理过程[5]。甚至儿童哮喘也能见到气道重塑现象。哮喘气道重塑以气道组织破坏和脱落、杯状细胞化生和增生、气道平滑肌增生和肥大为主要病理特征[6]，可导致持续性气流受限,引起肺功能下降和气道高反应性。杯状细胞数量增多为特征的上皮结构病理改变是上皮重塑的主要特征，是哮喘启动、维持及加重的重要因素之一。当前临床上哮喘控制性药物(如糖皮质激素)主要针对气道炎症改变，而对上皮重塑作用有限[7],从而对黏液高分泌的症状改善功能有限。

蛋白酪氨酸激酶信号转导在气道上皮细胞活化与增殖中发挥重要作用，是气道上皮组织损伤和修复机制中必要和充分条件。EGFR是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,经EGF、TGF-α、TNF-α、HB-EGF等因子激活后发挥生物学效应。哮喘患者气道上皮组织高表达EGFR，与组织损伤、病情严重程度相一致[1]。吉非替尼可阻滞EGFR酪氨酸激酶磷酸化，给予哮喘小鼠吉非替尼干预可抑制气道杯状细胞增生，减轻气道黏液高分泌症状，控制气道炎症[8]，研究证实EGFR抑制剂可抑制哮喘大鼠气道上皮细胞增殖[9],但对气道上皮细胞凋亡的作用尚未见报道。

本研究构建哮喘模型后，观察到气道上皮组织脱落、气道杯状细胞增生及炎症细胞广泛浸润等病理改变，与相关报道[10]一致，证实该哮喘小鼠模型出现气道重塑。给予预防和治疗性吉非替尼干预后，上述症状均有所减轻，以吉非替尼预防组改善最为明显。实验中发现哮喘小鼠气道上皮组织高表达EGFR，与文献[7]一致；吉非替尼干预后活化的EGFR(p-EGFR)表达减少，以吉非替尼预防组减少最为显著,这一趋势与干预后气道重塑的相关病理改变相一致，提示EGFR信号传导在哮喘小鼠气道重塑中发挥重要作用,证实通过吉非替尼阻滞EGFR信号传导对哮喘小鼠气道重塑的防治具有一定作用，且早期预防性干预效果最佳。

既往研究发现与EGFR具有抑制气道上皮细胞凋亡的效应。Bax/Bcl-2在细胞中比例决定凋亡进程，研究发现EGFR可上调体外培养气道上皮细胞中Bcl-2表达，从而抑制细胞凋亡[11]，而EGFR信号传导下游通路PI3K/AKT的激活可诱导促凋亡蛋白Bax丝氨酸184磷酸化，促进Bax停留在细胞质中以及增加Bax与抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-xL形成异二聚体的作用，也具有抑制凋亡作用。本实验研究发现，吉非替尼预防组小鼠气道新生上皮细胞的凋亡数量明显增加，但吉非替尼治疗组较哮喘组差异不显著。吉非替尼预防与治疗两种干预措施在诱导凋亡方面的差异，提示药物的干预时机只有与增殖细胞的周期达到某种契合时方能表现出预期的效应。通过诱导新生细胞特别是杯状细胞的凋亡，是吉非替尼实现一定程度逆转气道重塑的主要机制之一。除Bax/Bcl-2之外，可能还有其它途径调控细胞凋亡，通过阻断EGFR信号传导诱导凋亡机制仍待深入研究。

总之，吉非替尼通过阻断EGFR作用于气道上皮这一哮喘发病的第一防线，能够降低气道炎症水平、减少杯状细胞数量及黏液高分泌，并通过凋亡途径减少上皮新生细胞达到一定的逆转气道上皮重塑的作用，为哮喘气道重塑的防治提供了新的思路。

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(收稿：2014-11-11)

The inhibitive effects of gefinitib on the airway epithelium remodeling of bronchial asthma in mice

Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Xijing Hospital, Fourth Military

Medical University (Xi’an 710032) Song Jiao Ma Zhanping Liu Dapeng et al

Objective：To evaluate the treatment effects of gefinitib,a selective Epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor, on the airway remodeling in asthmatic mice.Methods： BALB/c mice were randomly divided into a sham-challenged asthmatic group, an asthma group, a gefinitib prevention group (prevention group), and a gefinitib treatment group (treatment group). HE staining detected the inflammatory lesions of lung tissues and the proliferation of airway epithelium in mice of all groups. PAS staining detected the cell counting and mucus secretion of airway goblet cells in mice of all groups. TUNEL method detected apoptosis of lung tissues in mice of all groups. Western blot method was used to detecte p-EGFR and EGFR protein expression of lung tissues in mice of all groups. Results：Compared with the sham-challenged asthmatic group, there were more significant inflammatory lesions of lung tissues, increasing numbers of airway goblet cells in mice of asthma group. These pathological change were improved in mice of both prevention group and treatment group and especially in the prevention group (P<0.05, respectively). Compared with the asthma group, there were significantly less expression of p-EGFR in mice of both prevention group and treatment group and especially in the prevention group (P<0.05, respectively). Compared with the asthma group, the apoptosis rate of airway epithelium was increased in mice of prevention group (P<0.05), and there was no significant difference between the asthma group and treatment group (P>0.05). Conclusion： Gefinitib have some protective effects on airway epithelium remodeling of asthmatic mice, and its mechanism may be blocking the EGFR signaling and inducing the apoptosis of asthma airway epithelial cells.

Receptor,epidermal growth factor Asthma Airway remodeling Apoptosis

*国家自然科学基金面上项目(81070029)

受体,表皮生长因子 哮喘 气道重塑 细胞凋亡

R562.25

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.002

△新疆生产建设兵团第二师库尔勒医院呼吸科

#陕西省中医药研究院

▲通讯作者