SF/PLCL纺丝材料复合骨髓间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究

郑欣 ，李东亚，陈一心，邱旭升，朱彦丞，施鸿飞 ，王骏飞，熊进

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院 骨科，江苏 南京 210008；2.徐州医学院附属医院 骨科，江苏 徐州 221000)

·论 著·

SF/PLCL纺丝材料复合骨髓间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究

郑欣1，李东亚2，陈一心1，邱旭升1，朱彦丞1，施鸿飞1，王骏飞1，熊进1

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院 骨科，江苏 南京 210008；2.徐州医学院附属医院 骨科，江苏 徐州 221000)

目的:研究SF/PLCL纺丝材料复合骨髓间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的能力。方法:取兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)并制成BMSCs/藻酸钙水凝胶。选择8只6月龄雄性新西兰兔，于双侧桡骨中段制备15 mm大段骨缺损模型。其中实验组双侧植入SF/PLCL后注入BMSCs/藻酸钙水凝胶；对照组单纯行双侧桡骨缺损手术。所有兔于术后12周行CT检查观察骨缺损修复情况，之后处死兔，大体及组织学观察骨修复情况。结果：术后12周CT及组织学检查显示:实验组纺丝材料塌陷，材料部分降解，纤维细胞长入材料内部；骨缺损断端有骨组织沿套管材料生长，但骨缺损未完成桥接。对照组缺损区域软组织填充，骨缺损断端封闭。结论：SF/PLCL套管材料虽具有良好的生物相容性，但尚不足以用于修复兔桡骨骨缺损，其成骨能力及降解能力有待进一步提升。

丝素蛋白；聚左旋乳酸—己内酯；桡骨；骨缺损；兔

骨组织工程技术是将种子细胞种植于支架材料后植入骨缺损部位，随支架材料降解，种子细胞增殖分化为成骨细胞，进而完成骨缺损的修复，现已广泛应用于修复大段骨缺损的基础研究[1-3]。丝素蛋白(silk protein， SF)属天然衍生物材料，聚左旋乳酸—己内酯(polyL-lactide-co-caprolactone，PLCL)为人工合成高分子材料，两者在体内均可完全降解且无毒副作用，是常用的骨组织工程支架材料。本课题组前期研究中，成功建立了6月龄雄性新西兰兔桡骨骨缺损动物模型[4]。本研究中将SF/PLCL复合兔骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells， BMSCs)构建组织工程骨，用于修复新西兰兔桡骨缺损，探讨其成骨能力，以期为骨组织工程研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1主要试剂及仪器 主要试剂为海藻酸钠干粉(上海贺宝化工公司)、PBS培养液、氯胺酮、3%戊巴比妥钠、青霉素。主要器械及仪器为:骨髓穿刺包、骨科常用手术器械、X线摄片机(OPTIMUS 500MA，荷兰PHILIPS公司)、CT(Lightspeed 16层螺旋CT，美国GE公司)。

1.1.2实验材料及实验动物 SF/PLCL套管材料(内径为4 mm)，与兔桡骨中段直径相适应，经60Co消毒备用(该材料由东华大学材料学院制备提供)。选取6月龄雄性新西兰兔[由南京大学医学院附属鼓楼医院动物中心提供，动物质量许可证号:SCXK(苏)2006-0009]，体重3.0～3.5 kg，妊娠分娩正常，无明显生长发育异常、肿瘤等疾病。

1.2 实验方法

1.2.1兔BMSCs的分离、培养及成骨诱导 3只实验兔以3%戊巴比妥钠静脉麻醉成功后，无菌操作下，于股骨头行骨髓穿刺术抽取骨髓约5 ml，置于离心管中保存。将采集到的抗凝骨髓用密度梯度离心法分离骨髓中的单个核细胞。运用差速贴壁法纯化细胞，4～5 d传代1次。收集4～6代MSCs，并调整浓度为2×106个·ml-1。将海藻酸钠干粉(Sigma Aldrich)溶于超纯水中，浓度为1.5%，磁力搅拌2 h后以0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用。将1 ml细胞PBS悬液(约2×106MSC细胞)缓慢加入4 ml藻酸钠溶液中，制成含细胞混悬液。以湿热灭菌的1.132%CaCl2凝胶化，制成BMSCs/藻酸钙水凝胶，分装于注射器内备用。

1.2.2兔桡骨缺损模型的建立及SF/PLCL套管置入 选取6月龄雄性新西兰大白兔8只，随机分为实验组及对照组，各4只。适应性饲养1周后采用3%戊巴比妥钠20 mg·kg-1麻醉，将双侧前臂备皮后仰卧位固定于兔板，消毒铺单，于前臂桡侧中上段切开皮肤、皮下组织及筋膜，分离肌肉至桡骨骨膜；以桡骨弧顶为中点，去除桡骨骨膜，用装载直径10 mm砂轮磨片的骨科电钻将桡骨截除，并仔细分离缺损区域内残留骨膜，分别制作缺损长度为15 mm的骨缺损。术中使桡骨骨缺损两断面均垂直于尺骨纵轴，截除桡骨后用 20 ml 生理盐水将缺损处骨碎屑、骨髓组织等彻底冲洗干净。实验组双侧缺损处植入SF/PLCL套管材料后注入BMSCs/藻酸钙水凝胶，对照组仅制造双侧桡骨15 mm骨缺损，不植入任何材料(图1)。依次缝合肌膜及皮下组织、皮肤，碘伏消毒切口并仔细包扎，单笼饲养。术后连续3 d肌肉注射青霉素 80 万单位，切口每天予碘伏消毒换药直至2周拆线。

1.2.3观察指标 记录兔的进食、活动等一般情况，切口有无红肿、渗出等表现。于术后12周摄X线片，并进行CT扫描三维重建，观察骨缺损修复情况；影像学检查完成后处死实验兔，大体观察后留取标本行HE染色，组织学观察骨修复情况。

2 结 果

2.1 术后一般情况

切口无红肿、渗液等炎症反应，均一期愈合，实验兔进食和日常活动正常。术后4周时，实验组1只实验兔左侧尺骨骨折，在进行组织学及影像学分析时该只兔骨折侧不予计入结果分析。

A.SF/PLCL套管材料；b.实验组SF/PLCL套管材料植入兔桡骨大段骨缺损；c.对照组桡骨中段15 mm缺损的大段骨缺损

图1 SF/PLCL套管材料及植入兔体内术中照片

2.2 大体观察

术后12周，处死实验兔可见:实验组7侧桡骨缺损处均见SF/PLCL套管材料塌陷，骨缺损断端有骨组织沿套管材料生长，但骨缺损未完成桥接；对照组7侧缺损区域软组织填充，骨缺损断端封闭(图2)，1侧缺损区域尺骨侧见少量凹凸不平的新骨生成。

2.3 影像学结果

CT扫描三维重建图像显示:实验组7侧桡骨中有6侧骨缺损断端见骨组织沿套管走行生长，但骨缺损仅少量连接，1侧缺损区域未见明显新骨生成。对照组见骨缺损断端封闭，8侧均未见缺损修复(图3)。

2.4 组织学结果

实验组SF/PLCL套管材料塌陷，套管内侧壁有骨细胞黏附，纤维细胞长入材料内部，缺损未修复；对照组缺损区域软组织填充，骨缺损断端封闭(图4)。

3 讨 论

组织工程研究中，支架材料需具有仿天然细胞外基质的结构和生物活性等特点。静电纺丝技术可制作出相互连接的多孔网络状仿生非编织支架[5]，而且可通过调整溶液酸碱度、电场强度、温度和湿度，调控纤维直径和取向等参数[6]。应用静电纺丝技术将可生物降解的聚合物制作而成的纳米纤维支架，能够促进细胞黏附、伸展、增殖、迁移，提高组织再生能力，可用于各种组织修复与再生[7-9]。

静电纺丝组织工程支架材料SF具有良好的生物相容性、氧气和水蒸气渗透性及生物降解性，且较胶原蛋白引起的炎症反应更小，同时SF提取纯化方式简单，成本低廉，但其机械性能较差，不足以维持支架外形[10-12]。而PLCL是左旋乳酸和己内酯的共聚物，其降解率和机械性可通过乳酸和己内酯的比例进行调整[13]。何晓敏等[14]在利用胶原/PLCL复合纳米纤维电纺膜构建组织工程化气管补片的研究中，分离培养兔肋软骨细胞，并构建细胞材料复合物，体外培养4周后植入裸鼠背部皮下，4周后取出进行组织学染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测，实验结果表明，胶原/PLCL复合纳米纤维电纺膜对兔肋软骨细胞有良好的生物相容性，复合肋软骨细胞的组织工程化软骨，适合构建组织工程化气管补片。PLCL最大的缺陷是缺乏自然的细胞识别点[15]，SF/PLCL静电纺丝复合多孔管状材料可结合二者的优点，既具有良好的细胞黏附性，又具备一定的机械强度。李纲等[16]在关于SF/PLCL纳米纤维支架构建组织工程化角膜上皮的研究中，静电纺丝溶液中SF和PLCL的质量比为25∶75 ，构建的纳米纤维薄膜平均纤维直径为(715±186) nm，植于材料上复合培养的细胞生长良好，均匀分布，他们认为，角膜上皮细胞与SF/PLCL纳米纤维膜的生物相容性良好。SF/PLCL静电纺丝复合材料具有良好的生物相容性、可控的机械性及降解率，但应用于修复大段骨缺损的研究尚少，因此，我们试将SF/PLCL复合兔骨髓基质干细胞构建组织工程骨，用于修复新西兰兔桡骨骨缺损，观察其修复骨缺损的能力。

A.对照组术后12周，桡骨中段15 mm缺损，缺损断端封闭，未见骨缺损愈合；b、c.实验组术后12周，见新生成骨组织沿SF/PLCL套管材料侧面生长，SF/PLCL套管材料塌陷，材料部分降解，骨缺损未完全愈合

图2 术后12周两组桡骨标本外观照片

A.对照组术后12周，桡骨中段15 mm缺损大段骨缺损，缺损断端封闭，未见骨缺损愈合；b.实验组术后12周，见缺损断端有新骨生成，但不足以修复骨缺损

图3 两组术后12周桡骨CT三维重建

A.实验组术后12周，SF/PLCL套管材料(M)部分降解，套管内径见新骨生长(箭头所示) HE×10；b.实验组术后12周，缺损处见SF/PLCL套管材料部分降解，并发现纤维细胞(箭头所示)长入套管材料 HE×40；c.对照组术后12周，桡骨中段15 mm 缺损大段骨缺损，缺损断端封闭，缺损区域见纤维组织填充(箭头所示)，未见骨缺损愈合 HE×10

图4 组织学图片

在修复骨缺损的研究中，建立科学合理的骨缺损动物模型具有重要意义[1,17]。课题组在前期研究中，采用6月龄雄性新西兰兔，对兔桡骨大段骨缺损动物模型进行了探讨[4]。而既往研究中关于术后观察骨缺损修复的时间点各不相同。Bodde等[18]认为，术后8周到12周的时间段是骨缺损完成修复的一个过渡阶段。为了较完整地观察骨缺损修复过程，我们选择12周作为骨修复的术后观察时间。术后12周，对照组实验兔桡骨缺损均未愈合，证实了本研究成功构建了兔桡骨大段骨缺损动物模型；而实验组在组织学切片中可观察到，SF/PLCL支架材料已部分降解，支架材料内已长入纤维细胞，表明该材料具有良好的生物相容性，但与对照组相比较，该复合材料的成骨能力尚须改善，材料构成及复合种子细胞的方式需进一步优化。

综上所述，虽然静电纺丝SF/PLCL管状材料具有良好的生物相容性，然而实验结果中观察到其尚不足以修复兔桡骨大段骨缺损，其成骨能力及降解能力有待进一步研究及改良。

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Repair of radius detection by SF/PLCL spinning composited with BMSCs in rabbits

ZHENG Xin1，LI Dong-ya2，CHEN Yi-xin1，QIU Xu-sheng1，ZHU Yan-cheng1，SHI Hong-fei1，WANG Jun-fei1，XIONG Jin1

(1.DepartmentofOrthopaedics，theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool，Nanjing210008，China; 2.DepartmentofOrthopaedics，theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000，China)

Objective: To study the osteogenic potential of SF/PLCL electrospinning material composited with bone mesenchymal stem cells (BMSCs) in repairing the radius defection in rabbits. Methods: BMSCs were obained from rabbits and then mixed for BMSCs/Alginate hydrogel. Eight 6-month-old male New Zealand white rabbits were recruited and 15 mm defect was created in both sides of the radius. In the experimental group， SF/PLCL spinning composited with BMSCs/alginate hydrogel was implanted into the bone defect. In the control group， only bilateral surgery of radial defect was performed. Twelve weeks postoperatively， CT scan reconstruction were used to evaluate the bone formation. Then the rabbits were sacrificed and the specimens were harvested for histologic study. The specimens were embedded in paraffin， followed by decalcification and then stained by hematoxylin and eosin (HE) for histomorphometric analysis to evaluate the bone repair. Results:Twelve weeks postoperatively， CT scan reconstruction and HE staining showed that SF/PLCL spinning degraded partly in the experimental group， and the bone formed along the casing stump， but the bone defect was not fully bridged; While in the control group， the defect was filled with soft tissue， and the ends of bone defects were closed. Conclusion: SF/PLCL casing material in this study shows good biocompatibility， but its osteogenic ability and degradation need to be further refined.

silk protein; polyL-lactide-co-caprolactone; radius; bone defect; rabbits

2015-01-29

2015-02-13

国家自然科学基金项目(81401793);江苏省社会发展基金项目(BE2011604);江苏省六大人才高峰项目(2012-WS-092);南京市卫生局项目(YKK13079、ZKX12016)资助

郑欣(1985-)，男，江苏东台人，主治医师，医学博士。E-mail:thindy1980@163.com

陈一心 E-mail:chenyixin93@126.com

郑欣，李东亚，陈一心，等.SF/PLCL纺丝材料复合骨髓间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究[J].东南大学学报:医学版，2015，34(3)：376-380.

R683

A

1671-6264(2015)03-0376-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.010