内皮祖细胞对氧糖剥夺/复氧损伤神经元的保护作用

李子惠，柏盈盈，居胜红

(1.东南大学医学院 分子与功能影像实验室，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 放射科，江苏 南京 210009)

·论 著·

内皮祖细胞对氧糖剥夺/复氧损伤神经元的保护作用

李子惠1，柏盈盈1，居胜红2

(1.东南大学医学院 分子与功能影像实验室，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 放射科，江苏 南京 210009)

目的:研究内皮祖细胞(EPCs)共培养对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤神经元是否有保护作用。方法:分离培养新生小鼠的海马神经元，利用缺氧培养室建立神经元OGD/R模型。分离培养小鼠骨髓源性EPCs，采用Transwell小室建立EPCs与OGD/R损伤神经元的共培养系统。将神经元随机分为4组，即对照组、OGD/R组、EPCs共培养组及EPCs共培养并加入一氧化氮合酶(eNOS)抑制剂(L-NAME)组。神经元凋亡率用TUNEL荧光法检测。用Western blot法检测神经元caspase 3及内皮型eNOS活性。结果：OGD/R组神经元的细胞凋亡率和caspase 3活性较对照组显著增加。与OGD/R组相比，EPCs共培养组神经元凋亡情况显著降低(P<0.05),且eNOS磷酸化水平明显增高(P<0.05)。而与EPCs共培养组相比，EPCs+L-NAME组神经元凋亡情况明显增加(P<0.05)，且eNOS磷酸化水平也明显下降(P<0.05)。结论：与EPCs共培养可以通过提高神经元eNOS的活性来保护OGD/R损伤的神经元。

内皮祖细胞；神经元；氧糖剥夺/复氧；共培养；内皮型一氧化氮合酶

脑卒中是全球第二大致死性疾病，其中80%为缺血性脑卒中[1]。应用重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)是治疗急性脑卒中的主要方法[2]，但时间依赖性极强[3]，且患者远期存活率无明显改善[4]。因此，亟待寻找治疗脑卒中的新方法。脑卒中早期及时挽救缺血半暗带内的神经元有利于患者神经功能的改善和恢复，是目前脑卒中治疗的关键[5]。

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)对缺血缺氧组织有定向归巢的特性，研究表明小鼠心肌梗死后移植EPCs可通过上调一氧化氮合酶(eNOS)活性来促进心脏功能的恢复[6]。通过上调eNOS/BDNF通路，原代神经元缺血缺氧性损伤可有所改善[7]。研究证明，移植EPCs可改善脑卒中小鼠的愈后[8]，但具体的作用机制尚不明确。我们设想体外EPCs共培养能通过提高神经元eNOS活性来保护氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)损伤的神经元，故进行了实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

新生C57BL/6乳鼠，SPF级。C57BL/6小鼠，4周龄，体重10～12 g，SPF级，雄性。购自扬州大学比较医学中心，动物许可证编号scxk(苏)2012-0004。

Neurobasal-A/B27培养基(美国Gibco公司)，EGM-2 MV培养基(美国Vector Laboratries公司)，anti-β-Tubulin Ⅲ 兔抗小鼠抗体(美国Sigma公司)，Dil-Ac-LDL(美国Biomedical Technologies公司)，FITC-UEA-1(美国Sigma公司)，anti-CD34、anti-CD133、anti-VEGFR-2、anti-active+pro Caspase 3、anti-eNOS及anti-p-eNOS兔抗小鼠抗体(美国Abcam公司)，AlexaFluo 488/594羊抗兔二抗(美国Abcam公司)，TUNEL试剂盒(美国Roche公司)，L-NAME(美国Sigma公司)。

缺氧培养室(日本三菱)，Transwell小室(美国Millipore公司)，激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)，Tanon5200化学发光成像仪(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1神经元的培养及鉴定 参照Kaech[9]的方法，取新生C57BL/6乳鼠消毒后断头取脑，分离两侧海马并剪成小块。胰酶消化20 min，加入血清轻柔吹打分散细胞。离心5 min后弃上清液，用含血清DMEM/F12培养基重悬。经200目筛网过滤，调节细胞密度为1×106个·ml-1，加入PLL包被的6孔板。4 h后将培养基换成Neurobasal-A/B27，以后每3 d半量换液。

取第8天的神经元爬片行抗β-Tubulin Ⅲ抗体免疫荧光染色[10]，荧光显微镜下随机选取3个高倍镜视野，计算β-Tubulin Ⅲ阳性细胞占90%以上。

1.2.2神经元OGD/R模型 随机选取6孔板的神经元，将培养基换成无糖Earle′s液，放入缺氧培养室，半小时后缺氧室内氧气含量小于0.1%。氧糖剥夺4 h后取出细胞，恢复到正常培养条件24 h。

1.2.3EPCs的培养及鉴定 参考Bai等[11]的方法， 取4周龄C57BL/6小鼠颈椎脱臼法处死，依次置于碘伏、酒精中消毒。分离两侧股骨和胫骨，PBS冲洗骨髓腔并分散细胞。将细胞悬液加到淋巴细胞分离液上，以2 500 r·min-1离心30 min后收集中间白色云雾层。PBS离心洗涤，EGM-2 MV培养基重悬，接种到FN包被的培养瓶中，以后每4 d换液，待细胞铺满瓶底后传代。取生长良好的EPCs以1×106个·ml-1的密度接种于Transwell小室备用。

观察细胞生长情况，取生长良好的第2代EPCs行抗CD34、CD133、VEGFR-2抗体免疫荧光染色。另一方面取生长良好的EPCs，细胞免疫荧光法检测其内吞Dil-ac-LDL及结合FITC-UEA-1的功能，统计得双阳性细胞占90%以上。

1.2.4实验分组 实验随机分为4组:(1) 对照组；(2) OGD/R组；(3) EPCs共培养组；(4) EPCs共培养并加入eNOS抑制剂(Nω-nitro-L-arginine methyl ester， L-NAME)组。

1.2.5共培养方法 EPCs组神经元氧糖剥夺4 h后恢复到正常培养环境中，并插入接种了EPCs的Transwell小室进行24 h共同培养。EPCs+L-NAME组是在EPCs共同复氧的同时加入L-NAME，终浓度约1 μmmol·L-1。

1.2.6TUNEL神经元凋亡检测 步骤按照Roche TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书。各组用激光共聚焦显微镜随机取7个100倍镜视野计算阳性细胞比例。

1.2.7Western blot法测定神经元的active caspase 3及p-eNOS的相对表达情况 提取各组神经元总蛋白，每组取等量样本经SDS-PAGE凝胶电泳后转至硝酸纤维膜上，室温下封闭2 h。加入一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜后加入二抗，室温下孵育2 h。应用Tanon 5200系统曝光成像，测量灰度值，每组重复3次。使用的一抗有anti-active+pro Caspase 3(1∶1 000)、anti-eNOS(1∶1 000)、anti-p-eNOS(1∶1 000)、anti-β-actin(1∶2 000)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 神经元及EPCs的形态、鉴定

神经元培养8 d后分化成熟，突起互相交织成网状(图1A、B)且抗β-Tubulin Ⅲ免疫荧光鉴定显示红色荧光主要位于胞质及突起内(图1C)。

A.神经元培养第8天(bar=50 μm)；B.神经元培养第8天(bar=20 μm)；C.神经元抗β-Tubulin Ⅲ 抗体免疫荧光鉴定(bar=30 μm)

图1 海马神经元的形态及鉴定

EPCs培养4 d后贴壁细胞较分散，呈纺锤形或不规则形(图2A)。EPCs培养10 d后细胞铺满瓶底，呈典型的“铺路石”状(图2B)，且均表达CD34、CD133、VEGFR-2特异性标志物(图2C)，同时细胞能内吞Dilac-LDL并结合FITC-UEA-1(图2D)。

2.2 EPCs共培养及L-NAME对神经元凋亡率的影响

各组神经元TUNEL荧光染色见图3A。对照组神经元凋亡率低(3.29%±0.81%)，OGD/R组凋亡率明显增加(24.87%±1.96%)。EPCs组神经元凋亡率(13.53%±3.04%)较OGD/R组减低(P<0.05)。而EPCs+L-NAME组神经元凋亡率(17.90%±3.91%)较EPCs组又有所增加(P<0.05)。见图3B。

2.3 EPCs共培养及L-NAME对神经元active caspase 3相对表达水平的影响

将对照组神经元经pro caspase 3校正后的active caspase 3相对表达水平设为1。OGD/R组神经元active caspase 3相对表达水平较对照组明显提高。EPCs组较OGD/R组显著下降(P<0.05)。而EPCs+L-NAME组较EPCs组有提高(P<0.05)。见图4及表1。

A.EPCs培养第4天(bar=50 μm)；B.EPCs培养第10天(bar=50 μm)；C.EPCs特异性表面标志物鉴定(bar=30 μm)；D.EPCs功能学鉴定(bar=30 μm)

图2 内皮祖细胞的形态及鉴定

2.4 EPCs共培养及L-NAME对神经元p-eNOS相对表达水平的影响

将对照组神经元经eNOS校正后的p-eNOS相对表达水平设为1。OGD/R组神经元p-eNOS相对表达水平较对照组下降，EPCs组较OGD/R组显著提高(P<0.05)，而EPCs+L-NAME组较EPCs组又有所下降(P<0.05)。见图5及表1。

3 讨 论

本研究发现，EPCs组与OGD/R组比较，神经元细胞凋亡率及active caspase 3相对表达水平均显著降低，充分说明EPCs共培养对缺血缺氧损伤的神经元具有保护作用。而加入L-NAME后，细胞凋亡率及active caspase 3相对表达水平较EPCs组均显著提高，说明EPCs对神经元的保护作用有所减弱，提示EPCs可能通过eNOS保护神经元。为进一步验证实验设想，检测各组神经元p-eNOS及eNOS表达水平，p-eNOS为eNOS活性形式，结果表明EPCs组神经元p-eNOS相对表达水平较OGD/R组显著提高，而加入L-NAME后p-eNOS相对表达水平较EPCs组明显降低，说明p-eNOS在EPCs保护损伤神经元的过程中具有重要作用。

研究证明eNOS/BDNF通路在小鼠脑卒中后的神经发生[12]及脑白质修复[13]中发挥重要作用，另有研究显示，移植EPCs能促进脑卒中小鼠神经元轴突的生长及神经发生[14]，这些与本实验结果相一致。但Transwell小室中EPCs细胞无法通过聚酯膜，所以可能是EPCs分泌的细胞因子或信号分子促进了神经元内p-eNOS的表达，但具体尚不明确，需要进一步研究。

A.各组神经元TUNEL荧光染色图(bar=100 μm)；B.定量计算各组神经元凋亡率；与OGD/R组比较，aP<0.05；与EPCs组比较，bP<0.05

图3 神经元凋亡率检测

与OGD/R组比较，aP<0.05；与EPCs组比较，bP<0.05

图4 神经元active caspase 3相对表达水平

与OGD/R组比较，aP<0.05；与EPCs组比较，bP<0.05

与OGD/R组比较，aP<0.05；与EPCs组比较，bP<0.05

图5 神经元p-eNOS相对表达水平

一氧化氮合酶(NOS)存在3种亚型，即内皮型(eNOS)、诱导型(iNOS)及神经元型(nNOS)。本研究使用的L-NAME为非特异性NOS抑制剂，可同时抑制eNOS以外亚型的活性。抑制iNOS、nNOS能减少脑卒中小鼠神经元的损失[7]，其保护作用中和了抑制eNOS的损伤作用，但总体仍表现出抑制eNOS的损伤作用。后期实验可改进为使用eNOS特异性抑制剂L-NIO或者eNOS-/-小鼠，来排除干扰。

本研究通过建立体外EPCs与氧糖剥夺/复氧损伤神经元的共培养，观察到EPCs能显著提高神经元的p-eNOS相对表达水平，从而降低损伤神经元的active caspase 3相对表达水平及凋亡率，而加入L-NAME后EPCs的保护作用减弱，证明EPCs能通过提高神经元eNOS活性保护缺血缺氧损伤的神经元，并为EPCs治疗脑卒中的机制提供新的解释。

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Protective effect of endothelial progenitor cells on oxygen and glucose deprivation/reoxygenation injured neurons

LI Zi-hui1，BAI Ying-ying1，JU Sheng-hong2

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMolecularandFunctionalImaging，MedicalSchool，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofRadiology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To investigate whether endothelial progenitor cells(EPCs) co-culture has protective effect on oxygen and glucose deprivation/reoxygenation(OGD/R) injured neurons. Methods: Hippocampal neurons were isolated and cultured from newborn mice， and OGD/R model of neurons was performed using a hypoxia chamber. EPCs were isolated from the bone marrow of mice， and Transwell was used to build the co-culture system of EPCs and the OGD/R injured neurons. Neurons were randomly divided into four groups:the control group， the OGD/R group， the EPCs co-culture group and the EPCs+nitric oxide synthase inhibitor(L-NAME) group. Neuronal apoptosis rate was detected by TUNEL assay. Western blot was used to detect caspase 3 and endothelial nitric oxide synthase(eNOS) activity. Results: Neuronal caspase 3 activity and apoptosis rate were significantly increased in the OGD/R group compared with the control group. Neuronal apoptosis was significantly decreased and eNOS phosphorylation was increased in the EPCs co-culture group compared with the OGD/R group. However， the EPCs+L-NAME group showed increased neuronal apoptosis and decreased eNOS phosphorylation compared with the EPCs co-culture group. Conclusion: EPCs co-culture can protect OGD/R injured neurons by promoting the activation of eNOS.

endothelial progenitor cells; neurons; oxygen glucose deprivation/reoxygenation; co-culture; endothelial nitric oxide synthase

2014-12-26

2015-02-02

国家自然科学基金资助项目(81371538)

李子惠(1989-)，女，江苏泰州人，在读硕士研究生。E-mail:zihuili0731@hotmail.com

居胜红 E-mail:jsh0836@hotmail.com

李子惠，柏盈盈，居胜红.内皮祖细胞对氧糖剥夺/复氧损伤神经元的保护作用[J].东南大学学报：医学版，2015，34(3)：347-352.

R743.3

A

1671-6264(2015)03-0347-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.003