氯化钴化学乏氧对人肺癌A549细胞生长及侵袭、迁徙能力的影响

李芳洪昆黄瓅苏晓丽胡成平(.郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科　河南郑州　450000;.岳阳职业技术学院　湖南岳阳　44000;.中南大学湘雅医院呼吸与危重症医学科　湖南长沙　40008)

氯化钴化学乏氧对人肺癌A549细胞生长及侵袭、迁徙能力的影响

李芳1洪昆2黄瓅3苏晓丽3胡成平3
(1.郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科河南郑州450000;

2.岳阳职业技术学院湖南岳阳414000;
3.中南大学湘雅医院呼吸与危重症医学科湖南长沙410008)

【摘要】目的探讨氯化钴化学乏氧对人肺腺癌A549细胞生长及迁徙、侵袭能力的影响。方法采用氯化钴(CoCl2)建立人肺腺癌A549细胞体外化学乏氧模型。首先通过倒置相差显微镜、电镜、MTT法及流式细胞学观察CoCl2对A549细胞形态、增殖及细胞周期的影响;进一步利用Transwell小室模型检测CoCl2对A549细胞侵袭及迁徙能力的影响。结果与常氧对照组相比，200 μmol/L CoCl2化学乏氧组A549细胞光镜下较稀疏，电镜下出现线粒体肿胀、内质网扩张及自噬泡形成等微观结构改变，生长曲线低平、增殖缓慢，G1期细胞比例增多、S期细胞比例减少;迁徙及侵袭能力增强。结论CoCl2化学乏氧抑制人肺A549细胞的增殖，诱导G1/S周期阻滞，增强A549细胞的侵袭及迁徙能力。

【关键词】氯化钴;肺腺癌;增殖;侵袭;迁徙

肺癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，并且是引起癌性死亡的首要原因，在男性和女性癌性死亡原因中分列第1位和第2位［1］。在常见的非小细胞肺癌的病理类型中，肺腺癌的发病率明显增加［2］。然而，由于肺癌细胞具有恶性增殖及早期即远处侵袭、转移的生物学特点［3］，多数患者确诊时已属晚期，丧失手术机会，严重影响患者预后。近年来，研究发现实体性肿瘤普遍存在乏氧微环境，与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等密切相关。因此，本实验以人肺腺癌A549细胞为研究对象，采用氯化钴(CoCl2)建立体外A549细胞化学乏氧模型，观察乏氧微环境对肿瘤细胞生长及侵袭、转移等生物学特性的影响，为进一步研究其机制奠定实验基础。

1　材料与方法

1.1细胞及主要试剂人肺腺癌A549细胞株(中南大学湘雅医学院细胞中心)，DMEM培养基(Gibico公司)，热灭活胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，碘化吡啶(PI)、氯化钴(CoCl2，分子量237.93，美国Sigma公司)，FN(美国Roche公司)，Transwell小室(美国Millipore公司)，溴化二甲基噻唑尔本四氮唑(MTT)(美国AMRESLO公司)，二甲基亚砜(DMSO，北京鼎国生物技术有限公司)。

1.2研究方法

1.2.1 A549细胞乏氧培养与分组A549细胞于10%胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃、50 ml/L CO2、饱和湿度的细胞培养箱(美国Forma Scientific公司)中培养，80%汇合时换无血清培养液继续培养24 h，使其同步化后，吸弃原培养液，加入含终浓度为0、200 μmol/L CoCl2［4］的10%胎牛血清的DMEM培养液，其中0 μmol/L CoCl2组为常氧组;200 μmol/L CoCl2组为乏氧组。

1.2.2 A549细胞的形态及结构检测常氧组及乏氧组A549细胞放置于37℃、50 ml/L CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h后，从培养箱中取出。

1.2.2.1倒置显微光镜下观察各组A549细胞的形态将上述细胞放置在倒置显微镜(日本Olympus公司)物镜下，按放大倍数，依次通过目镜观察A549细胞的形态。

1.2.2.2透射电镜观察各组A549细胞的微观结构将上述细胞给予1×D－Hank’s漂洗1～2次后，用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打成均匀的细胞悬液后，加入1×PBS 5 ml，4℃条件下，1 000转/min离心10 min后，吸弃上清液，加入2.5%的戊二醛溶液固定2 h后，再用1%锇酸固定液固定2～3 h，1×PBS漂洗3次，4℃条件下，依次用50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水，然后用纯丙酮+包埋液依次包埋过夜后，置入烘箱在不同温度下固化，超薄切片机切片(50～60 nm)，3%醋酸铀－硝酸铅进行双染，透射电镜JEM－2000EX(日本JEOL公司)观察、拍片。

1.2.3 A549细胞生长、增殖检测常氧组及乏氧组A549细胞放置于37℃、50 ml/L CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。当细胞生长24、48、72、96 h，每孔加入20 μl MTT溶液，继续培养4 h后，予以1×DHank’s漂洗1～2次，再加入150 μl DMSO，将培养板放置在振动摇床上缓慢振荡至甲瓒蓝颗粒完全溶解后，将96孔培养板置入酶联免疫检测仪(美国Bio－Rad公司)检测盒中，于570 nm处测量各孔的吸光度值(OD)，再以OD值绘制细胞生长曲线。

1.2.4 A549细胞周期检测常氧组及乏氧组A549细胞放置于37℃、50 ml/L CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，4℃条件下，1 000 r/min的转速离心10 min，重悬细胞于0.6 ml的1×PBS液，再加入1.4 ml预冷的75%乙醇混匀后，4℃固定过夜，上机前离心收集细胞，将细胞重悬于1×PBS液中，50 μg/ml PI溶液37℃避光染色30 min，流式细胞仪(美国Beckman公司)进行细胞周期检测。每组设3个平行管，并重复3次实验。

1.2.5 A549细胞侵袭能力检测

1.2.5.1制备条件培养基用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5%CO2培养箱内培养A549细胞，在细胞长势良好的情况下换无血清DMEM培养基继续培养24 h，收集上清液，过滤除菌，－20℃保存备用。

1.2.5.2侵袭能力检测分别取50 μl 0.05/L FN，50 μl Matrigel胶均匀包被Transwell小室底部的反面和正面，室温风干;各组细胞培养24 h后，常规消化细胞，将200 μl细胞悬液接种于上室，细胞终密度为1× 108/L;下室加入含20% FBS的DMEM培养基及条件培养基各200 μl，将Transwell小室放入24孔培养板内共同培养，每组设5个复孔;置37℃、5% CO2培养箱内培养24 h后，取出Transwell小室;小心擦去微孔滤膜上层的细胞，固定、染色穿过微孔滤膜侵袭至下室的细胞;在200倍倒置显微镜下计数侵袭穿膜细胞数，每张膜随机选取10个视野;取各组侵袭穿膜细胞数的平均值，最后按以下公式计算各组细胞的侵袭率:细胞侵袭率(%)=侵袭穿膜细胞数(实验组)/侵袭穿膜细胞数(常氧组)×100%。

1.2.6 A549细胞迁徙能力检测

1.2.6.1制备条件培养基同1.2.5.1。

1.2.6.2迁徙能力检测［5］各组细胞培养24 h后，常规消化细胞，将200 μl细胞悬液接种于上室，另设空白组，只加200 μl细胞培养基而不加细胞悬液，细胞终密度为1×109/L;下室加入含20% FBS的DMEM培养基及条件培养基各200 μl，将Transwell小室放入24孔培养板内共同培养，每组设5个复孔;置37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，取出Transwell小室，MTT法测各孔OD值;取各组OD值的平均值，按以下公式计算各组细胞的迁徙率:细胞迁徙率(%)=(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100%。

1.3统计学方法数据录入SPSS 16.0统计软件，定量资料采用均数±标准差(±s)表示，两组之间的均数比较用t检验。每个实验重复3次，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 A549细胞微观形态、结构的变化光镜下观察A549细胞均贴壁良好，轮廓清晰，形态呈长梭形或圆形，部分细胞伸出伪足，与常氧组相比，乏氧组未见脱落A549细胞增多以及大片A549细胞脱壁的现象。见图1。电镜下观察A549细胞微观结构，结果显示:常氧组及乏氧组A549细胞切面均成类圆形，细胞膜外有不等量纤毛，细胞浆内线粒体(↓)丰富;与常氧组相比，乏氧组A549细胞胞浆内内质网()管腔明显扩张，部分线粒体明显肿胀，基质疏松、嵴断裂、模糊;可见自噬体()形成，未见明显凋亡小体。见图2。

2.2 A549细胞的生长、增殖A549细胞培养0、24、48、72、96 h后，MTT法检测A549细胞的生长、增殖，结果显示:常氧组A549细胞24 h后即成对数生长，96 h后进入生长平台期，生长曲线成S型。乏氧组A549细胞48 h进入对数期生长，72 h后进入生长平台期，生长曲线趋于低平。见表1、图3。

表1　两组A549细胞生长、增殖情况比较(±s)

注:与常氧组比较，aP＜0.05。

组别0 h　24 h　48 h　72 h　96 h常氧组　0.17±0.02 0.47±0.07 0.88±0.17 1.79±0.38　 1.83±0.44乏氧组　0.18±0.02 0.20±0.03a0.36±0.06a0.50±0.09a0.55±0.10a

2.3 A549细胞周期的影响A549细胞24 h后，流式细胞术检测A549细胞周期分布，结果显示:常氧组与乏氧组A549细胞均以G1期为主。但乏氧组A549细胞G1期比例较常氧组增多(P＜0.05); S期比例较常氧组减少(P＜0.05)，G2期比例差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2、图4。

2.4 A549细胞侵袭和迁徙能力的影响在肿瘤细胞转移过程中，多种物质可刺激肿瘤细胞发生定向趋化运动，本实验应用A549细胞自身分泌的上清液为趋化因子，通过直接计数侵袭穿膜细胞数及侵袭率、MTT比色法测定微孔滤膜进入含趋化因子的下室贴壁细胞OD间接计算各组A549细胞的迁徙率，探讨CoCl2化学乏氧对A549细胞侵袭、迁徙能力的影响，结果显示:乏氧组A549细胞侵袭率及迁徙率均较常氧组增加(P＜0.05)。见图5、表3。

表2　A549细胞周期分布(±s，%)

注:与常氧组比较，bP＜0.05。

组别　n　G1期　S期　G2期常氧组3　 48.80±2.48　 36.86±2.13　 12.34±0.55乏氧组　3　 68.67±3.01b　15.67±1.76b14.38±2.39

3　讨论

实体性肿瘤如肺癌、肝癌等常呈失控性生长，导致瘤内低氧。研究表明几乎所有的实体肿瘤中均有乏氧细胞存在，距离功能性血管100～150 μmol/L处即可发生［6］。目前建立乏氧细胞模型的方法主要有两种:一种是在乏氧培养箱中培养实验细胞，即物理乏氧;它可以真实的反映肿瘤细胞乏氧微环境，但是，乏氧培养箱价格昂贵，从而一定程度上限制其在乏氧实验中的广泛开展。另一种乏氧方法是常氧条件下，在细胞培养液中加入一些化学物质，通过抑制氧信号的传导达到乏氧，即化学乏氧。其中，CoCl2是在正常氧条件下通过细胞内离子置换，导致亚铁螯合酶失活，阻止线粒体产生ATP，使线粒体内呼吸障碍，从而达到细胞乏氧的目的，与细胞物理乏氧刺激具有相同的氧感受、信号转导和转录调节机制，且具有经济、方便、无毒的特点，在低氧研究中被广泛应用［7－8］。

表3　 A549细胞的侵袭率及迁徙率(±s，%)

注:与常氧组比较，cP＜0.05。

组别　n 侵袭率　　迁徙率常氧组3100±0　100±0乏氧组　3　326±17c　298±42c

既往研究通过光镜观察缺氧时肿瘤细胞的形态，发现缺氧可导致肿瘤细胞体积变小，形态趋向圆形，似消化过程中间的细胞形态，伪足少且短，折光率减弱、贴壁能力下降等改变［9］。然而，可能受细胞类型、CoCl2干预浓度及观察时间的影响，本实验化学乏氧组A549细胞在光镜下与常氧对照组形态基本一致，贴壁良好，未见脱落细胞增多以及大片细胞脱壁等现象，但是电镜下化学乏氧组A549细胞不仅出现线粒体肿胀、内质网扩张，而且出现自噬体。近年来研究显示，在缺氧等应激存在时，内质网扩张诱导内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及细胞自噬对促进细胞生存、维持细胞自我稳态具有双重作用。一方面，二者同线粒体一样，通过激活caspase－12、caspase－9、caspase－3等，切割多种蛋白质底物，引起“瀑布式”的级联反应，形成凋亡小体，最终诱导细胞凋亡［10－11］;另一方面通过激活p38SAPK激酶，使肿瘤细胞处于长期休眠状态［12］，或通过降解细胞内受损的蛋白、细胞器，合成新的大分子和ATP，减少氧耗，维持乏氧条件下细胞的存活［13］。本实验电镜下乏氧组A549细胞内未发现凋亡小体，可能与二者在低浓度(≤200 μmol/L)［14］CoCl2化学乏氧24 h条件下对A549细胞生存起促进作用有关和(或)是其他抗凋亡途径激活。

除细胞结构发生改变外，本实验通过MTT方法观察CoCl2化学乏氧对离体A549细胞的生长、增殖的影响，结果示常氧条件下A549细胞呈S型曲线迅速生长，倍增时间短，对数生长期长; CoCl2化学乏氧条件下，A549细胞生长曲线低平，对数生长期延迟且短暂，过早进入生长平台期。细胞生长受细胞周期调控，细胞周期由G1期、S期和G2期3个阶段构成，其中G1和G2期的细胞属于静止状态，而S期的细胞则属于增殖状态，因此S期的细胞比例多少可以反映细胞增殖的速度及生长的活力。本实验通过流式细胞仪PI技术检测乏氧对A549细胞周期分布的影响，结果示CoCl2化学乏氧24 h后，A549细胞G2期比例较常氧对照组无明显差异;但是G1期细胞较常氧对照组细胞逐渐增多，S期细胞逐渐减少，同吴欣爱等在食管癌细胞研究相似［15］。以上研究结果提示CoCl2化学乏氧可能通过诱导G1/S期阻滞抑制A549细胞增殖。

侵袭性生长及远处转移是恶性肿瘤区别良性肿瘤的重要特征。近年来研究发现肿瘤乏氧微环境是促使肿瘤细胞发生转移的始动因素［16］。在肿瘤细胞转移过程中，侵袭、迁徙是必不可少的环节。国内学者景绍武、蒋富强等［17－18］研究发现乏氧条件下，食管癌Eca109细胞及乳腺癌MCF－7细胞的侵袭、迁徙能力较常氧组明显增加。在肿瘤细胞转移过程中，多种物质可刺激肿瘤细胞发生定向趋化运动，本实验应用A549细胞自身分泌的上清液为趋化因子，通过直接计数侵袭穿膜细胞数及侵袭率、MTT比色法测定微孔滤膜进入含趋化因子的下室贴壁细胞OD值间接计算各组A549细胞的迁徙率，结果示乏氧组人肺腺癌A549细胞的侵袭能力及迁徙能力亦较常氧组增强，与胡振红等［19］研究相似。

综上所述，本实验采用低浓度(≤200 μmol/L)CoCl2建立化学乏氧环境，电镜下发现人肺腺癌A549细胞内质网扩张，出现自噬体，其G1/S期阻滞，A549细胞生长、增殖受抑，但A549细胞侵袭能力及迁徙能力较常氧条件下明显增强。而其具体机制将在后续实验中进一步研究。

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·论著·

Effect of CoCl2induced chemical hypoxia on proliferation，invasion and migration in human lung adenocarcinoma A549 cells

Li Fang1，Hong Kun2，Huang Li3，Su Xiaoli3，Hu Chengping3
(1.Department of Respiratory and Critical Diseases，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China;

2.Yueyang Vocational Technical College，Yueyang 414000，China;

3.Department of Respiratory and Critical Diseases，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410007，China)

【Abstract】Objective To investigate the effect of CoCl2induced chemical hypoxia on proliferation，invasion and migration in human lung adenocarcinoma A549 cells.Methods CoCl2was utilized to establish chemical hypoxia model of human lung adenocarcinoma A549 cells.First，inverted light and electron microscope，MTT assay and flow cytometry were used to observe the effect of CoCl2on the morphology and structure，proliferation and cell cycle of A549 cells.Then，transwell booth model was used to detect the capability of cellular invasion and migration of A549 cells.Results Compared with control group，there were fewer cells and mitochondrial swelling，endoplasmic reticulum expansion and autophagic vacuoles in A549 cells of CoCl2group，with low and flat growth curve，more G1phase cells and less S phase cells，while the ability of migration and invasion were both increased.Conclusion CoCl2induced chemical hypoxia inhibited cell proliferation，induced G1/S arrest，and enhanced the ability of invasion and migration in human lung A549 cell.

【Key words】CoCl2; lung adenocarcinoma; proliferation; invasion; migration

(收稿日期:2015－03－16)

通讯作者:胡成平，E－mail: huchengp28@126.com。

doi:10.3969/j.issn.1004－437X.2015.06.001

【中图分类号】R 734.2