HPLC-ELSD法同时测定三叶青中胡萝卜苷和β-谷甾醇的含量

丁 丽，章璐幸，邱 彦

(1．浙江医药高等专科学校药学系，浙江宁波 315100;2．厦门大学医学院，福建厦门 361102)

三叶青为葡萄科植物三叶崖爬藤(Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg)的干燥块根，是浙江民间常用药之一。现代药理研究表明，三叶青具有解热镇痛、抗炎、抗病毒、保肝及抗肿瘤等作用［1－7]。三叶青中含有酚类、糖类、黄酮类、甾体类及油脂类等多种成分［8－9]，其中，胡萝卜苷具有免疫调节作用［10]，而 β-谷甾醇具有降血脂、抗肿瘤、抗炎等作用［11－12]。谷甾醇是胡萝卜苷的苷元，课题组在预试验中发现，二者在三叶青中的含量较接近，已有文献报道三叶青中β-谷甾醇的含量测定［13]，但未见有同时测定三叶青中此2种成分的报道。本实验采用HPLC-ELSD法同时测定三叶青中胡萝卜苷和β-谷甾醇的含量，为三叶青药材质量标准的建立提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);蒸发光散射检测器(Agilent 380);XS 1050DU型电子分析天平(Mettler Toledo公司)。

β-谷甾醇对照品(中国食品药品生物制品检定所，批号110851－201407，纯度≥98%);胡萝卜苷对照品(北京北纳创联生物技术研究院，批号20140926，纯度≥98%);甲醇(色谱纯);三叶青药材分别购自杭州市和宁波市各药店，经浙江医药高等专科学校中药系杨雄志教授鉴定为Tetrastigma hemsleyanum Diels et．Gilg的干燥块根。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为岛津VPN-ODSC18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相为甲醇;体积流量为0．7 mL ·min－1，柱温为30℃;进样量20μL;蒸发光检测器，以氮气为载气，漂移管温度60℃，体积流量1．8 L·min－1。理论塔板数按胡萝卜苷计不低于4 000，分离度均大于1．5。色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)和三叶青药材(B)HPLC色谱图

2．2 对照品溶液的制备 取胡萝卜苷和β-谷甾醇对照品适量，精密称定，置于100 mL的量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即制成含胡萝卜苷0．05 g ·L－1和 β-谷甾醇0．1 g·L－1的混合对照品溶液。

2．3 供试品溶液的制备 将三叶青药材粉碎，过30目筛，取粗粉约3 g，精密称定，置150 mL圆底烧瓶中，加入乙酸乙酯50 mL，水浴加热回流6 h，趁热过滤，取滤液，旋干溶剂，残渣用甲醇溶解后转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度。

2．4 线性关系 分别精密吸取混合对照品溶液2．0、5．0、10．0、20．0、30．0、40．0 μL，按“2．1”项色谱条件测定峰面积，以峰面积的常用对数为纵坐标(Y)、对照品所进质量的常用对数为横坐标(X)，进行线性回归，得胡萝卜苷的回归方程为Y=0．696X+2．737，r=0．999 7;β-谷甾醇的回归方程为 Y=0．752 X+2．909，r=0．999 6。结果表明，胡萝卜苷在进样量为0．1～2．0 μg线性关系良好，β-谷甾醇在进样量为0．2～4．0μg线性关系良好。

2．5 精密度试验 精密吸取对照品溶液20μL，按“2．1”项色谱条件，重复进样6次。以胡萝卜苷和β-谷甾醇的峰面积计算，RSD分别为 1．64%、0．55%。

2．6 稳定性试验 取同一份供试品溶液(广西)，按“2．1”项色谱条件，在制备后 0、2、4、6、8、10、12 h后分别进样，以胡萝卜苷和β-谷甾醇峰面积计算，结果RSD分别为1．79%、1．13%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2．7 重复性试验 取广西产三叶青粗粉，按“2．3”项下方法，制备6份供试品溶，按“2．1”项色谱条件测定，测得结果胡萝卜苷和β-谷甾醇的平均质量分数分别为 0．062 mg·g－1和 0．154 mg·g－1，RSD 分别为2．03%和 1．36%。

2．8 加样回收率试验 取广西产三叶青药材1．5 g粉碎，过30目筛，精密称定，置150 mL圆底烧瓶中，加入含 0．050 20 g·L－1胡萝卜苷和 0．1153 g·L－1β－谷甾醇的混合对照品溶液2 mL，按“2．3”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按“2．1”项色谱条件测定，计算胡萝卜苷和β-谷甾醇的加样回收率分别为99．32%和100．13%，RSD分别为1．71%和 1．43%。

2．9 样品测定 取不同产地的药材，按“2．3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录胡萝卜苷和β-谷甾醇的峰面积，取“2．2”项下对照品溶液，分别进样10、20μL。按外标二点法计算胡萝卜苷和β-谷甾醇的质量分数，结果见表1。

表1 三叶青药材中胡萝卜苷和β-谷甾醇测定结果

3 讨论

本实验考察了安捷伦ZORBAX SB－ODSC18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)和岛津 VPN －ODSC18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)，结果表明后者能获得较好的峰形与分离度。选择流动相时，比较了甲醇－水、乙腈－水和甲醇3种流动相，结果以甲醇分离效果最佳。本实验还考察了丙酮、乙酸乙酯、70%乙醇、95%乙醇4种有机溶剂的提取效率，发现乙酸乙酯提取药材中的两种成分含量均较高;同时对提取方式、提取时间、物料比进行了考察，得出最佳提取条件。

三叶青药材化学成分较多，目前主要以黄酮类成分研究居多［14－15]。本实验选取胡萝卜苷和β－谷甾醇2种指标成分作为三叶青药材的评价依据，对5个产地的三叶青药材中胡萝卜苷和β－谷甾醇进行定量测定，结果发现:浙江产三叶青中胡萝卜苷和β-谷甾醇的含量均较其他产地高，2种成分含量的高低与三叶青药材药理作用的相关性有待进一步研究。本方法简便，结果准确、可靠，可作为三叶青药材中胡萝卜苷和β-谷甾醇的测定方法，为三叶青的质量控制提供实验依据。

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