加校正因子的主成分自身对照法测定奥硝唑片和胶囊中有关物质含量

耿庆光，王 发

(陕西省食品药品检验所，陕西西安 710061)

奥硝唑是继甲硝唑、替硝唑后上市的抗厌氧菌和抗滴虫药物，其抗厌氧菌和抗原生质感染、抗毛滴虫的作用均高于前两者。临床上用于毛滴虫引起的男女泌尿生殖道感染，阿米巴原虫引起的肠、肝阿米巴虫病，贾第鞭毛虫病，厌氧菌感染、术后感染和口腔感染等。奥硝唑的耐受性良好，不良应较少，有皮肤过敏反应、消化系统反应、循环系统反应等［1－3]。《中国药典》2010年版第二增补本奥硝唑片和胶囊采用自身对照法测定有关物质［4]，限度为杂质总量不得超过1．0%。但原料项下有关物质的测定为:杂质Ⅰ按外标法以峰面积计算，不得超过0．2%，其它各杂质和不得超过0．5%。为比较两种方法之间的差异，我们对收集到的137批奥硝唑制剂(片剂和胶囊两种剂型)按标准对有关物质项进行了测定，分别用主成分自身对照法和外标法对杂质Ⅰ进行计算，结果自身对照法的计算结果比外标法的大，为更加准确的控制奥硝唑制剂中有关物质的含量，参考相关文献资料［5－9]，建立了加校正因子的主成分自身对照法测定奥硝唑片和胶囊中有关物质含量的方法，具体方法和结果如下。

1 仪器与试药

1．1仪器 岛津 LC-30AD色谱仪，UV检测器，赛多利斯BBS-224S型电子分析天平。

1．2 试剂和样品 杂质Ⅰ对照品(2-甲基-5-硝基咪唑)，中检所提供，批号:100512－200802，含量99．8%;奥硝唑对照品，中检所提供，批号:100608－201102，含量100．0%;137批奥硝唑制剂分别由9个企业提供;试剂:甲醇为色谱纯，水为高纯水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 色谱柱:Agilent C18(250 mm×4．6 mm，5μm);流动相:甲醇—水(20 ∶80);检测波长:318 nm;柱温:35℃，流速:1．0 mL·min－1，进样体积:20μL，记录色谱图至主峰保留时间的1．5倍。

2．2 溶液的制备

2．2．1 供试品溶液的制备 精密称取供试品细粉适量(约相当于奥硝唑100 mg)，置100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置50 mL量瓶中，用流动相稀释到刻度，摇匀即得。

2．2．2 对照溶液的制备 精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释到刻度，摇匀即得。

2．2．3 对照品溶液的制备 精密称定杂质Ⅰ对照品9．99 mg(实际含杂质Ⅰ为9．97 mg)，置100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用流动相稀释到刻度，摇匀，再精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释到刻度，摇匀即得。

2．2．4 系统适应性溶液的制备 取供试品溶液适量，加热回流1 h，放冷至室温，与对照品溶液1∶1混合即得。

2．3 系统适应性试验 取“2．2”项下系统适应性溶液，照“2．1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，各色谱峰分离度符合要求。典型色谱图见图1。

2．4 检测限 取杂质Ⅰ对照品溶液，用流动相逐步稀释，按“2．1”项下色谱条件进样测定，确定杂质Ⅰ的检测限为0．019 94 mg·L－1(信噪比约为3)。

2．5 重复性试验 取奥硝唑片和胶囊各一批，分别测定6次，测得杂质Ⅰ的含量分别为0．055%和0．039%，RSD 分别为1．9%和2．3%，表明方法重复性良好。

图1 典型色谱图

2．6 回收率试验 精密称取上述奥硝唑片和胶囊细粉适量(约含奥硝唑100 mg)6份，各精密加入对照品溶液250 μL(相当于杂质Ⅰ:0．05 μg)，按2．2项下方法制备相应溶液，测定，按外标法计算回收率，结果杂质Ⅰ的回收率为 99．1% 和 99．5%，RSD 为 3．3%和2．9%，表明方法回收率良好。

2．7 样品的测定 按“2．2”项下方法，分别制备对照溶液、对照品溶液和样品溶液，分别进样20μL，记录色谱图至主峰保留时间的1．5倍。分别按照外标法，主成分自身对照法对检出的杂质Ⅰ进行计算。结果显示主成分自身对照法的计算结果比外标法的大，测定结果见图2。

图2 外标法和自身对照法计算样品中杂质Ⅰ的结果比较

2．8 响应因子的测定 精密称奥硝唑对照品10．46 mg，置100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，摇匀，精密量取上述溶液和对照品贮备液各5 mL，同置50 mL量瓶中，用流动相稀释到刻度，摇匀。精密量取此混合溶液适量，用流动相稀释成奥硝唑浓度为5．230 0、1．046 0、0．523 0、0．209 2、0．104 6 mg·L－1，杂质Ⅰ浓度为4．985 0、0．997 0、0．498 5、0．199 4、0．099 7 mg·L－1的系列对照品溶液，即得校正因子系列浓度溶液。依上述色谱条件进样测定，记录保留时间和峰面积，分别得到杂质Ⅰ和奥硝唑的线性方程，将各线性方程的截距校正为0，得校准方程的斜率。通过计算，得到的杂质Ⅰ校正因子为 0．80(f=k奥硝唑/k杂质Ⅰ);相对保留时间为0．23(RRT=tR杂质/tR奥硝唑)。

表1 奥硝唑和杂质Ⅰ的线性方程及校正因子

用校正因子对杂质Ⅰ的峰面积进行校正后计算，并与外标法计算的结果进行比较，结果显示两者比较一致，测定结果见图3。

图3 外标法和加校正因子的自身对照法计算样品中杂质Ⅰ的结果比较

3 讨论

《中国药典》2010年版附录ⅪⅩF药品杂质分析指导原则指出:已知杂质对主成分的相对响应因子超出0．9～1．1范围时，宜用对照品对照法计算含量，也可用经验证的相对响应因子进行校正后计算，未知杂质的定量可用主成分的自身对照法计算［10]。本试验测得的校正因子为0．8，因此采用主成分自身对照法测定奥硝唑制剂中杂质Ⅰ的含量，会使其结果偏高。为了保证检验结果的准确性，建议将奥硝唑制剂中有关物质检查方法修改为:供试品溶液如检出杂质Ⅰ(相对保留时间为0．23)，采用加校正因子的主成分自身对照法对其峰面积进行校正，校正因子为0．8，其他杂质采用不加校正因子的主成分自身对照法计算，各杂质峰面积的和不得大于自身对照溶液主峰的面积(1．0%)，以更准确的反映奥硝唑制剂中杂质的含量。

［1] 方正明，吕 红，姚 蓝．奥硝唑不同剂型抗阴道毛滴虫作用的比较研究［J]．热带医学杂志，2010，10(11):1274 －1276．

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［4] 国家药典委员会．中国药典(第二增补本)［S]．北京:中国医药科技出版社，2010:334－335．

［5] 魏嘉陵，林畅伟．用加校正因子的主成分自身对照法测定苯扎贝特中杂质氯苯酪胺的含量［J]．药物分析杂志，2006，26(12):1848－1850．

［6] 郭福团．加校正因子的主成分自身对照法测定盐酸苯海拉明片中有关物质的含量［J]．海峡药学，2013，25(10):47 －49．

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［10]国家药典委员会．中国药典(二部)［S]．北京:中国医药科技出版社，2010:205．