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猪miR-135a-5p预测靶基因APC的鉴定

2015-03-22任慧波胡雄贵蒋思文彭英林

畜牧兽医学报 2015年4期
关键词:前体荧光素酶靶向

陈 晨,邓 缘,任慧波,朱 吉,胡雄贵,蒋思文,彭英林*

(1.湖南省畜牧兽医研究所,长沙 410131; 2.华中农业大学动物科技学院,武汉 430070)

猪miR-135a-5p预测靶基因APC的鉴定

陈 晨1,2,邓 缘1,任慧波1,朱 吉1,胡雄贵1,蒋思文2*,彭英林1*

(1.湖南省畜牧兽医研究所,长沙 410131; 2.华中农业大学动物科技学院,武汉 430070)

本研究旨在鉴定猪miR-135a-5p靶向脂肪发育的相关基因。首先,利用生物信息学软件分析发现,结肠腺瘤性息肉病(APC)基因的3′ 非翻译区(3′ UTR)具有两个与猪miR-135a-5p结合的潜在位点。其次,构建APC基因野生型(APC3′ UTR)和突变型(APC3′ UTR m1、APC3′ UTR m2、APC3′ UTR m3)3′ UTR双荧光素酶载体,并分别将其与miR-135a-5p mimics、阴性对照(NC)共转染PK-15细胞后检测荧光活性。结果显示:miR-135a-5p mimics显著降低APC3′ UTR和APC3′ UTR m2载体的荧光活性(P<0.05),而APC3′ UTR m1和APC3′ UTR m3载体的荧光活性得到完全恢复,表明miR-135a-5p主要结合在预测的第一个位点。进一步的分析表明,miR-135a-5p抑制猪前体脂肪细胞内源APC基因的mRNA和蛋白质表达水平。研究结果证实,猪miR-135a-5p靶向APC基因,且调控其表达。本试验为深入研究猪miR-135a-5p的生物学功能及其调控脂肪形成的作用机制提供了基础。

猪;miR-135a-5p;APC;靶标

microRNA(miRNA)是一类内源性的、保守的、长度为19~23个核苷酸的非编码小分子RNA[1]。miRNA在动物体内的主要作用机制是其“种子序列”通过结合靶基因的3′UTR,造成靶基因的降解或翻译抑制,进而影响机制的各种生命过程[2]。1993年,人们在秀丽隐杆线虫中首次发现miRNA lin-4[3]。2003年,科学家们在果蝇中发现第一个调控脂肪代谢和甘油三酯积累的miRNA,即miR-14[4]。此后,越来越多的调控脂肪发育的miRNAs及其作用的靶基因和网络通路不断被挖掘。然而,猪中关于miRNAs调控脂肪形成的功能研究还较为少见。本课题组前期研究通过构建5月龄大白猪和梅山猪背部脂肪组织的小RNA文库,采用Solexa高通量测序方法分析发现,miR-135a在大白猪中的表达量显著高于梅山猪[5],且后来的研究也发现,miR-135a在蓝塘猪肌肉组织中的表达量显著高于脂肪组织[6]。据此推测其可能参与调控脂肪发育。

结肠腺瘤性息肉病基因(Adenomatous polyposis coli,APC)是经典Wnt/β-catenin信号通路的关键成员,其通过负调控β-catenin,直接参与Wnt信号传导途径[7],且经典Wnt/β-catenin信号通路是脂肪形成的开关和主要的负调控因子[8]。研究发现,人miR-135a/b靶向APC基因,激活经典Wnt/β-catenin信号通路进而调控结肠直肠癌的发生[9]。然而,猪miR-135a-5p是否通过靶向APC基因参与经典Wnt/β-catenin信号通路进而调控猪的脂肪形成仍不得而知。本研究首先采用生物信息学对猪miR-135a-5p(ssc-miR-135a-5p)与APC基因3′UTR的结合进行预测,然后通过双荧光素酶报告试验、QPCR和蛋白印迹分析法在PK-15细胞和猪前体脂肪细胞中进行靶基因的鉴定,为进一步研究ssc-miR-135a-5p调控猪脂肪形成的生物学功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

ssc-miR-135a-5p寡核苷酸购自上海吉玛基因股份有限公司;引物购自上海生工有限公司;PCR快速扩增Mix购自上海莱枫生物科技有限公司;DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒及去内毒素质粒提取试剂盒均购自Omega公司;DNA marker、pMD-18T载体及T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司;XhoⅠ及NotⅠ内切酶、RNA反转录试剂盒购自Fermentas公司;DEME培养基和PBS购自HyClone公司;胎牛血清购自Gibco公司;lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司;FuGENE HD转染试剂和QPCR荧光染料购自Roche公司;psi-CHECK2载体及双荧光素酶试剂盒购自Promega公司;PVDF膜购自Millipore公司;APC一抗购自Abcam公司;β-actin一抗购自Santa Cruz公司;PK-15细胞系和猪前体脂肪细胞为华中农业大学动物科技学院猪遗传育种实验室保存。

1.2 ssc-miR-135a-5p与APC基因的结合预测

从miRBase(http://www.mirbase.org)获得猪和人的miR-135a-5p序列,比较其相似性。采用计算机软件TargetScan(http://www.targetscan.org/)和RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)对ssc-miR-135a-5p的“种子序列”与APC基因3′ UTR的结合进行预测。

1.3APC基因野生型及突变型3′ UTR双荧光素酶载体的构建

野生型载体构建:利用上游和下游引物(表1,a和d)PCR扩增包含两个潜在结合位点的APC基因的3′ UTR片段,扩增片段经DNA回收、纯化、连接pMD-18T载体、双酶切等一系列分子克隆操作后,将双酶切回收得到的APC基因3′ UTR片段连接至同样经XhoⅠ和NotⅠ双酶切的线性psi-CHECK2载体,构建重组质粒。得到的野生型双荧光素酶载体称为APC3′UTR。

突变型载体构建:以野生型APC3′UTR载体为模板,设计结合位点的突变引物(表1,b1和c1、b2和c2)来突变APC基因3′UTR中与miR-135a-5p“种子序列”结合的碱基,其突变原理见图1。以突变第一个结合位点为例,操作步骤:将扩增得到的ab1和c1d片段“搭桥”,反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,40 ℃ 30 s,45 ℃ 5 s,50 ℃ 5 s,55 ℃ 5 s,60 ℃ 5 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 5 min;25 ℃ 5 min。再以“搭桥”后的体系为模板,以a和d为引物进行PCR扩增,之后一系列的分子克隆操作同APC3′ UTR载体的构建。以此得到的突变型双荧光素酶载体称为APC3′UTR m1。同理,第二个结合位点突变和两个结合位点都突变的突变型双荧光素酶载体分别记为APC3′UTR m2和APC3′UTR m3。

表1 构建APC基因野生型及突变型3′UTR双荧光素酶载体引物

Table 1 Primer sequences for constructing dual-luciferase vectors ofAPC3′ UTR and its mutants

基因名称Gene基因登录号AccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence片段大小/bpSize退火温度/℃TmAPCNM_001206430.1a:CCGCTCGAGAAAGAGCTGGAATGATGAad:55759.4d:ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGCab1:16556.7b1:TATCAAATAACCGTTCCAGAACAAAAACTCc1d:41456.7c1:GTTCTGGAACGGTTATTTGATAGTATACCTab2:24256.7b2:ATATCCTTCCGATTACCATTTTCTTCc2d:33854.8c2:AATGGTAATCGGAAGGATATTTGTACc1b2:9958.0

阴影部分为突变碱基,粗体和斜体部分分别为酶切位点及其保护碱基

The letters highlighted with shadows represent the mutated nucleotides compared with the wild,and the bold and italic letters represent the restriction enzyme sites and its protective bases,respectively

A.第一个结合位点突变的3′ UTR片段的扩增;B.第二个结合位点突变的3′ UTR片段的扩增;C.两个结合位点都突变的3′ UTR片段的扩增A.Amplification of 3′ UTR fragment in which the first binding site was mutated;B.Amplification of 3′ UTR fragment in which the second binding site was mutated;C.Amplification of 3′ UTR fragment in which the 2 binding sites were both mutated图1 APC基因突变型3′ UTR片段的扩增示意图Fig.1 Schematic of amplification of mutated 3′ UTR fragment of APC gene

1.4 细胞培养及转染

PK-15细胞和猪前体脂肪细胞分别用含有10%胎牛血清的DMEM作为生长培养基,置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养。将PK-15细胞接种24孔细胞培养板,待细胞达到80%左右融合度,采用lipofectamine 2000试剂将0.2 μmol·L-1的miR-135a-5p mimics、阴性对照(NC)分别与0.4 μg的APC3′ UTR、APC3′UTR m1、APC3′UTR m2和APC3′UTR m3质粒共转染,共8个处理组。将猪前体脂肪细胞接种6孔细胞培养板,采用FuGENE HD试剂分别转染0.8 μmol·L-1的miR-135a-5p mimics和NC。miR-135a-5p mimics和NC序列见表2。

表2 miR-135a-5p寡核苷酸序列

Table 2 Oligonucleotide sequences of miR-135a-5p

名称Name序列(5'-3')SequencemiR-135a-5pmimicsUAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGAUCACAUAGGAAUAAAAAGCCAUAmiR-135a-5pNCUUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.5 双荧光素酶活性检测

转染24 h后收集PK-15细胞,用双荧光素酶试剂盒检测细胞荧光素酶活性,具体步骤详见其说明书。

1.6 QPCR分析

转染24 h后,采用Trizol试剂提取猪前体脂肪细胞中的总RNA。1 μg RNA经DNase I处理去除DNA污染。使用RNA反转录试剂盒进行cDNA链的合成,具体操作详见其说明书。APC基因的mRNA表达水平采用SYBR法进行定量,选择β-actin作为内参基因。基因的定量引物序列见表3。

1.7 Western blot分析

转染48 h后,猪前体脂肪细胞经PBS润洗,并用RIPA裂解缓冲液裂解,置于冰上。12 000 g离心5 min,收集上清液。使用核蛋白提取试剂盒收集核蛋白并测定其浓度。核蛋白中加入5×SDS缓冲液煮沸5 min后将其转至PVDF膜,使用一级抗体(APC和β-actin)与膜杂交,之后再和辣根过氧化物酶标记的二级抗体共孵育,采用ECL方法使膜显色。利用Image J软件对蛋白质条带进行灰度值分析。

表3 QPCR引物序列及参数

Table 3 Primer sequences and parameters for QPCR

基因名称Gene基因登录号AccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence片段大小/bpSize退火温度/℃TmAPCβ-actinNM_001206430.1DQ845171.1F:ATGAATGAACTAGGGGGACTR:TAGCCAACAAGGCTACACTAF:GGACTTCGAGCAGGAGATGGR:GCACCGTGTTGGCGTAGAGG16223362.9

1.8 数据分析

试验数据采用SPSS 16.0软件one-way ANOVA进行方差分析和显著性检验,结果以“平均值±标准误”表示。*表示P<0.05,即差异显著。

2 结 果

2.1 ssc-miR-135a-5p与APC基因3′ UTR的结合预测

通过将猪和人的miR-135a-5p序列进行比对,以及APC基因3′UTR在物种间保守性分析,TargetScan和RNAhybrid软件预测显示,ssc-miR-135a-5p可分别结合在APC基因3′ UTR的142~150和220~226 nt处(图2)。这表明APC基因可能是ssc-miR-135a-5p的靶标,且具有两个潜在结合位点。

2.2APC基因野生型及突变型3′UTR双荧光素酶载体的构建

以猪cDNA为模板扩增得到长度为532 bp的APC基因3′UTR片段(图3A)。连接此片段的pMD-18T载体的双酶切鉴定结果见图3B。构建的psi-CHECK2重组质粒经双酶切鉴定(图3C)和测序正确(未显示)。说明成功获得野生型APC3′UTR载体。

以野生型APC3′UTR载体为模板构建的APC3′UTR m1、APC3′UTR m2和APC3′UTR m3载体的测序结果见图4(分子克隆结果未显示)。结果表明,构建的载体在结合位点处成功突变,可用于后续的细胞研究。

图2 TargetScan和RNAhybrid软件预测miR-135a-5p与APC基因3′UTR的结合Fig.2 The binding of miR-135a-5p with APC 3′UTR predicted by TargetScan and RNAhybrid

A.APC基因3′ UTR片段(532 bp)的扩增;B.包含APC基因3′ UTR的pMD-18T载体的双酶切鉴定;C.包含APC基因3′ UTR的psi-CHECK2载体的双酶切鉴定。M1.DNA相对分子质量标准DL2000;M2.DNA相对分子质量标准DL10000;1.APC基因3′ UTR片段(532 bp);2、3.pMD-18T载体的Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切鉴定;4、5.psi-CHECK2载体的Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切鉴定A.Amplification of the 3′UTR fragment of APC gene (532 bp);B.Double-digested identification of pMD-18T vector containing the 3′UTR of APC gene;C.Double-digested identification of psi-CHECK2 vector containing the 3′UTR of APC gene.M1.2 000 bp DNA ladder (2 000,1 000,750,500,250,100 bp);M2.10 000 bp DNA ladder (10 000,7 000,4 000,2 000,1 000,500,250 bp);1.The 3′ UTR fragment of APC gene (532 bp);2,3.Identification of pMD-18T vector double-digested by Xho Ⅰ and Not Ⅰ;4,5.Identification of psi-CHECK2 vector double digested by Xho Ⅰ and Not Ⅰ图3 APC基因野生型3′UTR双荧光素酶载体的构建Fig.3 Construction of dual-luciferase plasmid of APC 3′UTR

2.3 双荧光素酶活性检测

分别将ssc-miR-135a-5p mimics、NC与双荧光素酶报告载体APC3′UTR、APC3′ UTR m1、APC3′ UTR m2和APC3′ UTR m3共转染PK-15细胞,24 h后裂解收集细胞,检测双荧光素酶活性。结果显示:与阴性对照(NC)相比,miR-135a-5p mimics显著降低APC3′UTR载体的荧光活性(下降约31.12%);miR-135a-5p mimics显著降低APC3′UTR m2载体的荧光活性(下降约24.90%)。而在转染APC3′UTR m1和APC3′UTR m3载体的细胞中,miR-135a-5p mimics与NC处理组细胞的荧光活性并无显著差异(图5)。

2.4 ssc-miR-135a-5p对APC基因mRNA和蛋白质表达水平的调控作用

为进一步研究ssc-miR-135a-5p对内源APC基因的调控作用,分别将miR-135a-5p mimics及NC转染猪前体脂肪细胞,24和48 h后收集细胞用于APC基因mRNA和蛋白质表达水平的检测。结果表明,miR-135a-5p降低APC基因的mRNA表达量,但与对照组相比差异并不显著(图6)。如图7所示,对照组中APC蛋白的表达量几乎是mimics处理组中的两倍,说明miR-135a-5p强烈抑制APC蛋白的表达。

3 讨 论

miRNAs是一大类进化保守的调控基因表达的内源性小分子RNA,已发现其在组织发育、糖尿病发生、细胞增殖与分化等诸多生命进程中发挥重要的调控作用[10-13]。研究表明,miR-135a参与调节糖原吸收、干细胞静息、细胞迁移和侵袭以及肿瘤和癌症的发生等多种生理活动[14-18],然而,miR-135a参与调控脂肪形成的研究还未见报道。R.Nagel等[9]学者发现人miR-135a/b通过靶向APC激活经典Wnt/β-catenin信号通路,进而促进结肠直肠癌的发生。本课题组在构建大白猪和梅山猪背脂的小RNA文库中发现,miR-135a在瘦肉型大白猪中显著高表达[5]。结合前期研究成果[8],笔者推测miR-135a可能通过靶向APC-Wnt/β-catenin信号通路参与调控脂肪发育。

A.APC 3′UTR m1载体测序结果图(GCCA→CGGT);B.APC 3′UTR m2载体测序结果图(AGCC→TCGG);C.APC 3′UTR m3载体测序结果图(GCCA→CGGT、AGCC→TCGG)A.Peak chart of sequencing of APC 3′UTR m1 vector (GCCA→CGGT);B.Peak chart of sequencing of APC 3′UTR m2 vector (AGCC→TCGG);C.Peak chart of sequencing of APC 3′UTR m3 vector (GCCA→CGGT,AGCC→TCGG)图4 APC基因突变型3′UTR双荧光素酶载体测序结果Fig.4 The sequencing results of the mutated dual-luciferase vectors of APC gene 3′UTR

图5 PK-15细胞中双荧光素酶活性检测miR-135a-5p对APC基因3′UTR的调控Fig.5 The regulation of 3′UTR of APC by miR-135a-5p was detected by the dual-luciferase reporter assay in PK-15 cells

图6 QPCR检测猪前体脂肪细胞中miR-135a-5p对APC基因mRNA表达水平的调控Fig.6 The level of APC mRNA regulated by miR-135a-5p was detected by QPCR analysis in porcine preadipocytes

本研究利用TargetScan和RNAhybrid软件对ssc-miR-135a-5p的靶基因进行预测,发现ssc-miR-135a-5p与APC基因3′UTR具有两个潜在结合位点(图1),推测其为ssc-miR-135a-5p的一个靶基因。为了进一步确定ssc-miR-135a-5p是否真正靶向APC基因及其对内源APC基因的调控作用,首先应用重叠引物延伸PCR法[19]构建结合位点突变的psi-CHECK2荧光载体(图4)。双荧光素酶报告试验结果表明,ssc-miR-135a-5p与APC基因结合且主要结合在第一个位点(图5),这与人类的miR-135a/b靶向APC基因的研究结果一致[9]。然而有趣的是,过表达miR-135a-5p略微降低猪前体脂肪细胞内源APC基因的mRNA表达(图6),但却强烈抑制APC基因的蛋白表达(图7)。这可能是由ssc-miR-135a-5p与靶标APC的结合方式决定的,当miRNA序列与靶mRNA序列完全配对时引起靶mRNA的剪切和降解,这种情况多见于植物中;而动物体miRNA则是通过其“种子序列”与靶mRNA结合,倾向于抑制靶mRNA的翻译和蛋白质的表达[20]。综合上述结果,本研究证实APC是ssc-miR-135a-5p的靶基因且为其下调。

研究已表明,作为经典Wnt/β-catenin信号通路的关键成员,APC基因的状态直接参与调控胞内经典Wnt/β-catenin信号通路的转导及其活性[21-23]。此外,R.L.Miclea等[24]发现干涉APC基因的表达激活经典Wnt/β-catenin信号通路,进而抑制小鼠间充质干细胞样细胞KS483向成熟脂肪细胞的分化。然而,ssc-miR-135a-5p通过靶向APC基因是否调控经典Wnt/β-catenin信号通路及脂肪形成仍值得深入探讨。

A.APC蛋白的Western blot分析;B.APC蛋白的相对定量A.The level of APC protein was detected by Western blot;B.Relative quantification of APC protein图7 猪前体脂肪细胞中miR-135a-5p对APC蛋白表达水平的调控Fig.7 The regulation of APC protein by miR-135a-5p in porcine preadipocytes

4 结 论

综上所述,本研究通过双荧光素酶报告分析、QPCR和Western blot等体外试验证实ssc-miR-135a-5p靶向APC基因并调控其表达,为后续ssc-miR-135a-5p参与经典Wnt/β-catenin信号通路进而调控猪脂肪形成的研究提供了重要线索。

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(编辑 郭云雁)

Identification ofAPCas the Potential Target of miR-135a-5p in Pigs

CHEN Chen1,2,DENG Yuan1,REN Hui-bo1,ZHU Ji1,HU Xiong-gui1,JIANG Si-wen2*,PENG Ying-lin1*

(1.HunanInstituteofAnimalandVeterinaryScience,Changsha410131,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

This research aimed to investigate the potential target genes related to adipose tissue development.The bioinformatics softwares were used to predict the target gene of ssc-miR-135a-5p,and it was found that the 3′ UTR of adenomatous polyposis coli (APC) gene had 2 putative binding sites with miR-135a-5p.The wild-type (APC3′ UTR) and 3 mutated (APC3′ UTR m1,APC3′ UTR m2 andAPC3′ UTR m3) dual-luciferase vectors were constructed and then co-transfected into PK-15 cells with miR-135a-5p mimics or negative control (NC),respectively,and then the luciferase activity was detected.The results showed that miR-135a-5p mimics significantly decreased the luciferase activities ofAPC3′ UTR andAPC3′ UTR m2 vectors (P<0.05),whileAPC3′ UTR m1 andAPC3′ UTR m3 completely abolished the inhibitory effects of miR-135a-5p,which demonstrated that miR-135a-5p mainly binded with the first site in 3′ UTR ofAPCgene.Further analysis revealed that miR-135a-5p inhibited the levels of endogenousAPCmRNA and protein in porcine preadipocytes,which indicate that the target gene of ssc-miR-135a-5p isAPCgene and regulates its expression.Taken together,this study will provide new insight into the biological function of ssc-miR-135a-5p and its mechanism in regulating adipogenesis.

pigs;miR-135a-5p;APC;target

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.004

2014-07-08

湖南省科技计划项目(2014NK3036);国家自然科学基金(31401097)

陈 晨(1986-),男,河南开封人,助理研究员,博士,主要从事猪分子遗传育种的研究,Tel:0731-84611058,E-mail:2004chch@163.com

*通信作者:蒋思文,教 授,E-mail:jswhzau@163.com;彭英林,研究员,E-mail:ylpeng_1965@163.com

S828;S813.3

A

0366-6964(2015)04-0534-08

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如何判断靶向治疗耐药
N-末端脑钠肽前体与糖尿病及糖尿病相关并发症呈负相关
NNMT基因启动子双荧光素酶报告系统的构建及其与SND1靶向关系的验证
不同双荧光素酶方法对检测胃癌相关miRNAs靶向基因TIAM1的影响
重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达
靶向治疗 精准施治 为“危改”开“良方”
促胃泌素释放肽前体对小细胞肺癌的诊断价值
N-端脑钠肽前体测定在高血压疾病中的应用研究
靶向超声造影剂在冠心病中的应用