枣仁安神颗粒改善睡眠作用的量效、时效关系及对脑内细胞因子的影响*

张 颖，齐 越，吴 怡，秦文艳，朱竟赫，孟 莉，尤献民

（辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034）

枣仁安神颗粒改善睡眠作用的量效、时效关系及对脑内细胞因子的影响*

张 颖，齐 越，吴 怡，秦文艳，朱竟赫，孟 莉，尤献民

（辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034）

目的 研究枣仁安神颗粒改善睡眠作用的量效、时效关系，及对小鼠脑内相关细胞因子的影响。方法 采用戊巴比妥钠协同睡眠试验方法，以睡眠时间为指标，研究枣仁安神颗粒改善睡眠作用的量效、时效关系；采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定小鼠全脑白细胞介素－1β（IL－1β）和肿瘤坏死因子－α（TNF－α）的含量。结果 枣仁安神颗粒改善睡眠作用最短起效时间为连续给药5 d；最佳给药剂量为2 080 mg／kg，在剂量为4 160 mg／kg时药效减弱，表现为复杂的量效关系；给予枣仁安神颗粒2 080 mg／kg后，小鼠全脑IL－1β和TNF－α的含量明显降低。结论 枣仁安神颗粒改善睡眠作用时效关系明显、量效关系复杂，其改善睡眠作用由细胞因子介导。

枣仁安神颗粒；睡眠；白细胞介素－1β；肿瘤坏死因子－α

枣仁安神颗粒由酸枣仁、丹参、五味子3味中药组方，具有补心养肝、安神益智的功效，对由心肝血虚、神经衰弱引起的失眠、健忘、头晕、头痛有良好的治疗作用［1］。前期研究表明，枣仁安神颗粒有协同戊巴比妥钠延长小鼠睡眠时间的作用，其药效物质基础主要为斯皮诺素、丹酚酸B和五味子甲素等［2］。药理研究发现，睡眠时脑内产生多种物质，缺乏睡眠时这些物质又有不同的改变，由此调节和影响着睡眠；这些物质包括细胞因子，其中研究较多的细胞因子是白细胞介素－1β（IL－1β）和肿瘤坏死因子－α（TNF－α），各种电生理、生化和分子基因学方面的试验都证明了两者在正常生理性睡眠（自发性睡眠）中的调节作用［3－4］。本研究中旨在对枣仁安神颗粒改善睡眠作用的量效、时效关系进行研究，并对其影响小鼠脑内相关细胞因子进行初步分析。

1 动物、试剂与方法

1.1 材料

动物：昆明种小鼠，SPF级，18～22 g，雌性，由辽宁长生生物技术有限公司提供，合格证号为SCXK（辽）2010－0001。受试动物引进后在辽宁省中医药研究院实验动物中心饲养观察1周，实验室温度为20～25℃，实验室相对湿度为50%～60%。

药物与试剂：枣仁安神颗粒（辽宁省中医药研究院药学室提供，批号为20130401）；地西泮片（上海信谊药厂有限公司，批号为121201）；戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号为060222，用时用0.9%氧化钠注射液溶解配制），0.9%氧化钠注射液（华仁药业股份有限公司，批号为Q1303050）。IL－1β和TNF－α试剂盒均购于美国R＆D公司。

药液配制：枣仁安神颗粒提取物临用前用蒸馏水溶解，分别配制成质量浓度分别为208，104，52，26，13 g／L的溶液。

1.2 方法

改善睡眠作用的量效关系研究：选取健康SPF级昆明种小白鼠60只，体重18～22 g，雄性，按体重随机分为6组，每组10只。分别灌胃给予上述不同质量浓度的枣仁安神颗粒提取物，每10 g体重0.2 mL，即剂量为4 160，2 080，1 040，520，260 mg／kg，空白组给予同体积的蒸馏水，连续灌胃7 d，于末次给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠50 mg／kg，从开始注射戊巴比妥钠到翻正反射消失的时间为入睡潜伏期，从翻正反射消失到翻正反射恢复的时间为睡眠时间。记录各组小鼠入睡的潜伏期和睡眠时间，组间行t检验。

改善睡眠作用的时效关系研究：试验动物按体重随机分为5组，每组10只。给药组灌胃给予枣仁安神颗粒提取物溶液 2 080 mg／kg，连续灌胃时间分别为3，5，7，9 d。空白组给予同体积的蒸馏水，末次给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠50 mg／kg，分别记录各组入睡的潜伏期和睡眠时间。

对小鼠全脑IL－1β和TNF－α含量的影响：分组、给药方法同上。末次给药（水）30 min后，断头处死，冰浴上剥离全脑，滤纸吸干残留血液，快速称重。用冷磷酸盐缓冲液（PBS）研磨，4℃3 000 r／min，离心10 min，取上清液，酶标仪分别测定IL－1β和TNF－α的光密度，采用外标法计算含量（具体步骤详见试剂盒说明书）。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 改善睡眠作用的量效关系

结果见表1。可见在一定剂量范围内，枣仁安神颗粒改善睡眠作用的最佳剂量为2 080 mg／kg，主要表现为延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间（P＜0.01），缩短潜伏期（P＜0.05）。低于或高于此剂量，催眠作用消失，表现出复杂的量效关系。

2.2 改善睡眠作用的时效关系

结果见表2。可见枣仁安神颗粒（2 080 mg／kg）连续给药5 d时开始起效，表现为能延长小鼠的睡眠时间，与空白组比较有显著性差异（P＜0.05）；连续给药7 d和9 d时，与空白组比较，小鼠的睡眠时间和入睡潜伏期表现为显著差异（P＜0.05）。

表1 枣仁安神颗粒改善睡眠作用的量效关系（±s，n＝10）

表1 枣仁安神颗粒改善睡眠作用的量效关系（±s，n＝10）

注：与空白组比较，*P＜0.05，＃P＜0.01。下表同。

组别给药组空白组剂量（mg／kg）4 160 2 080 1 040 520 260－入睡潜伏期（s）203.8±23.96 189.5±27.51*223.4±39.73 209.5±13.66 222.9±12.20 216.0±28.73睡眠时间（min）25.80±12.10 73.10±31.15＃44.70±21.12 45.90±38.28 41.20±26.12 29.40±7.43

表2 枣仁安神颗粒改善睡眠作用的时效关系（±s，n＝10）

表2 枣仁安神颗粒改善睡眠作用的时效关系（±s，n＝10）

组别给药组 给药3 d给药5 d给药7 d给药9 d空白组剂量（mg／kg）2 080－入睡潜伏期（s）195.0±37.03 205.6±32.84 183.5±32.34*188.6±26.51*218.6±34.35睡眠时间（min）57.50±14.43 64.10±15.29*63.80±11.90*66.20±13.81*44.90±22.61

2.3 对小鼠全脑IL－1β和TNF－α含量的影响

结果见表3。可见灌胃给予小鼠枣仁安神颗粒2 080 mg／kg，连续7 d，能显著降低小鼠全脑IL－1β和TNF－α含量，与空白组比较有显著性差异（P＜0.05）。

表3 枣仁安神颗对小鼠全脑IL－1β和TNF－α含量的影响（±s，ng／L，n＝10）

表3 枣仁安神颗对小鼠全脑IL－1β和TNF－α含量的影响（±s，ng／L，n＝10）

组别空白组给药组IL－1β 467.6±80.33 382.4±46.99*TNF－α 3537±172 3377±147*

3 讨论

对于单一成分的药物，在一定范围内增加剂量，其药理作用也会随之增强。但对于多种成分的药物，随着剂量的增加，其不同成分药理作用的增强幅度不一定相同，集合起来的药理作用就会与实际剂量的比值、阈剂量、对药效的增强幅度有关，在一定范围内其药理作用可能相互抵消，或增强或减弱一方的作用。因此，中药理论中常有“小剂量、大剂量”药理作用相反的现象发生［5］。本试验中发现，枣仁安神颗粒灌胃给药最佳剂量为2 080 mg／kg，给药剂量增加到4 160 mg／kg时药效反而减弱，表现出复杂的量效关系。

在正常睡眠过程中，人体细胞因子的分泌有一定的昼夜节律性。有研究证明，细胞因子IL－1，IL－6及TNF在夜间睡眠时增加且具有催眠作用，TNF和IL－1共同调节生理性睡眠；另外，TNF－α mRNA，IL－1β mRNA及相应的受体能在脑中表达，同时其水平呈明显的昼夜节律性；但也有相反的报道，动物在苏醒时TNF－α和IL－1β明显升高，出现此结果可能由于睡眠剥夺所致［6］。本试验结果显示，枣仁安神颗粒连续灌胃7 d，能显著降低小鼠全脑 IL－1β和 TNF－α含量。文献［7］报道，IL－1β和TNF－α在睡眠期应显著升高，主要发生在丘脑下部、海马等部位，与本试验结果不一致，分析原因可能是取材部位不同，本试验测定部位为全脑。

参考文献：

［1］WS3－B－2164－96，卫生部药品标准·中药成方制剂（第十一册）［S］.

［2］Zhang Y，Diao YP，You XM，et al.Quality assessment of Zaoren an shen granule by High－performance liquid chromatography fingerprinting and quantitative analysis［J］.J Med Plant Res，2010，4（16）：1 628－1 636.

［3］王春燕，赵忠新.细胞因子与睡眠／剥夺的研究进展［J］.脑与神经疾病杂志，2004，12（2）：154－157.

［4］陈 睿，赵忠新.IL－1β及TNF－α对非快速眼球运动睡眠的影响及其调节机制［J］.解放军医学杂志，2008，35（8）：1 032－1 034.

［5］段金廒，范欣生，宿树兰，等.论中药双向调节作用机理［J］.河南中医学院学报，2003，18（6）：15－17.

［6］史智勇，赵红斌.细胞因子对睡眠的影响［J］.国外医学：生理、病理科学与临床分册，2000，20（4）：282－284.

［7］Lym C，Ping TS，Wang MF，et al.Brain distribution of cytokine mRNA induced by systemic administration of interleukin－1β or tumor necrosis factor α［J］.Brain Res，2006，1 120（1）：64－73.

Dose-Effect and Time-Effect Relationship of Improving Sleep Effect of Zaoren Anshen Granules and Its Influence on Mice Brain Cell Factors

Zhang Ying，Qi Yue，Wu Yi，Qin Wenyan，Zhu Jinghe，Meng Li，You Xianmin
（Liaoning Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Shenyang，Liaoning，China 110034）

ObjectiveTo study the dose-effect and time-effect relationships of Zaoren Anshen Granules for improving sleep effect and its influence on related mice brain cytokines.MethodsThe pentobarbital sodium（PS）collaborative sleep experiment was adopted to research the dose-effect and time-effect relationship of Zaoren Anshen Granules for improving sleep effect with the sleep time as the index；the enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）was used to determine the contentofIL-1β and TNF-α in mice brain.ResultsThe shortest effective onset time of Zaoren Anshen Granules for improving sleep was 5 d continuous administration；the optimal dose was 2 080 mg／kg；at the dose of 4 160 mg／kg，the drug effect was weakened，which was manifested by the complex dose-effect relationship；the content of IL-1β and TNF-α in mice whole brain was decreased obviously after administrating the dose of 2 080 mg／kg Zaoren Anshen Granules.ConclusionZaoren Anshen Granule improves sleep with obvious time-effect and complex dose-effect relationship，its effect for improving sleep might be mediated by the cytokines.

Zaoren Anshen Granules；sleep；IL-1β；TNF-α

R285.5；R286

A

1006－4931（2015）02－0032－03

张颖（1979－），女，博士研究生，副研究员，研究方向为中药药效物质基础及质量评价，（电子信箱）xuanxuanzy＠163.com；尤献民（1964－），男，大学本科，研究员，研究方向为中药新药开发，本文通讯作者，（电子信箱）youxianmin1120＠126.com。

2014－04－30）

*辽宁省科技厅博士启动基金项目，项目编号：20121099。