中国明对虾蛋白酶的分离纯化及其酶学性质研究❋

林建城，郑云忠，闵志勇

(莆田学院环境与生物工程学院，福建 莆田 351100)



中国明对虾蛋白酶的分离纯化及其酶学性质研究❋

林建城，郑云忠，闵志勇

(莆田学院环境与生物工程学院，福建 莆田 351100)

以中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)肝胰脏为材料，通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-100和DEAE-32柱层析纯化，经PAGE获得蛋白酶，该酶的比活力为96.752 U/mg。SDS-PAGE显示一谱带，测得酶亚基分子量为36.3 kDa，凝胶层析法测得酶分子量为100.9 kDa，推断该蛋白酶由3个相同亚基组成，等电聚焦电泳法测得酶的等电点pI为9.65。以酪蛋白为底物，研究蛋白酶催化反应的动力学参数。结果表明：蛋白酶的最适pH、最适温度、Km和Vmax分别为8.0、65 ℃、4.578 mg/mL和0.273 U/min；酶在pH为5.0～10.0范围内较稳定，在20～45 ℃之间具有较好的热稳定性，在50 ℃以上热稳定性迅速下降。Mg2+对酶活力没有影响，Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+和Hg2+对酶有不同程度的抑制作用，其中Hg2+的抑制作用最强，10 mmol/L Hg2+可使酶活力完全丧失，而Fe2+对酶有激活作用。EDTA对酶活力没有影响，推断该蛋白酶为非金属蛋白酶。

中国明对虾；蛋白酶；分离纯化；酶学性质

随着对虾养殖业的发展，对虾饵料种类繁多，了解对虾对饵料的消化能力，即进行对虾消化酶的种类、酶活力大小及其活力调控的研究是至关重要的。蛋白酶是对虾的主要消化酶，Guizani等[1]已从克氏原鳌虾(Procambarusclarkii)肝胰脏，而Fernández Gimenez等[2]从野生红虾(Pleoticusmuelleri)的肝胰脏中分别提取到蛋白酶，并阐明其消化生理；杨文鸽等[7]从中华管鞭虾(Solenoceracrassicornis)、潘滨等[8]从凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、杭虞杰等[9]则从南极磷虾(Antarctickrill)等不同的消化器官中分离纯化出蛋白酶，并阐明其催化特性，这些研究对虾的健康养殖起到重要的指导作用。此外，Cao等[10]还借助虾蛋白酶等对组织自溶作用，较好地回收了虾头中蛋白质等营养成分，揭示了虾蛋白酶的生理过程，有助于开发利用虾内源蛋白酶。

中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)也称“中国对虾”，经济价值高，是中国沿海的主要养殖虾类，其肝胰脏有较高的蛋白酶活力[11]。但对中国明对虾蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究国内外尚未见详细报道。本试验拟从中国明对虾肝胰脏中提取分离蛋白酶，对其酶学特性进行研究，旨在为对虾蛋白酶活力调控的研究奠定基础，为开发海洋生物蛋白酶、综合利用虾资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Sephadex G-100是Pharmacia产品，DEAE-32系Whatman分装，牛血清蛋白为标准蛋白，电泳使用的标准蛋白的分子量为19～117 kDa，凝胶层析法测定蛋白酶分子量使用的λ球蛋白(GBL 150 kDa)、牛白蛋白(BSA 67.0 kDa)、纤维素酶(CLL 52.0 kDa)、鸡卵蛋白(OA 45.0 kDa)和辣根过氧化物酶(HRP 44.0 kDa)均为天根生化科技有限公司出品，DH020-1载体两性电解质出自DGSC，酪氨酸等其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 酶的分离纯化 选取(15.0±1.0) cm大小活的健康中国明对虾于冰块上解剖，去除肠道、胃和其它附着物，取出肝胰脏作为提酶原料，样品按照1∶3(W∶V)加入预冷0.01 mol/LTris-HCl缓冲液(pH=7.5)，高速捣碎匀浆1 min，4 ℃下抽提4 h以上，冷冻离心(20 000×g)30 min，取上清液。依次采用30%、60%饱和度硫酸铵分级分离酶蛋白，收集的沉淀物用0.01 mol/LTris-HCl(pH=7.5)缓冲液透析，冷冻离心(20 000×g))30 min，收集沉淀得粗酶制剂。进一步经过Sephadex G-100分子筛凝胶柱层析(柱规格为2.6×60 cm)和DEAE-32离子交换柱层析(柱规格1.8cm×30cm)纯化。Sephadex G-100柱层析的洗脱液为内含0.2 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.5)，部分收集，每管4 mL，流速0.4 mL/min；DEAE-32柱层析用含0～1.0 mol/L NaCl的0.03 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.6)进行梯度洗脱，收集酶活力峰，进行纯度鉴定。

1.2.2 蛋白酶活力的测定 蛋白酶活力测定参照施特尔马赫[12]方法，略加修改如下：2 mL的测活体系中包含0.5 mL的2%酪蛋白底物(缓冲液配制)，1.45mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)，置37 ℃水浴恒温10 min后，加入50 μL酶液，反应20 min，后加入3 mL 5%三氯乙酸(TCA)终止反应，1 000 r/min离心10 min，取上清液测定其A275 nm。以先加5%TCA，再加酶液为空白对照。

1个酶活力单位(U)定义为：在上述条件下，每分钟产生1 μmoL酪氨酸所需要的酶量。比活力定义为每毫克酶蛋白中所具有的酶活力单位数(U)。

1.2.3 蛋白浓度测定 采用Bradford[13]方法进行，以牛血清蛋白为标准蛋白；用紫外吸收A280 nm表示分离纯化过程蛋白质含量。

1.2.4 酶纯度鉴定 经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检定，确定酶的纯度。

1.2.5 酶蛋白分子量的测定 采用SDS-PAGE测定其纯度与相对分子量，分离胶浓度是10.0%，浓缩胶浓度为3.0%，使用考马斯亮蓝R250染色。进一步采用Sephadex G-100凝胶层析法测定蛋白酶的分子量[14]，选用5种标准蛋白，以标准蛋白质分子量的对数(lgMw)为横坐标，各自洗脱体积Ve(mL)为纵坐标，绘制标准曲线；根据待测酶的洗脱体积，求得其分子量。

1.2.6 等电点的测定 采用等电点聚焦电泳法[15]，两性电解质载体pH为3.5～10，4 ℃下150 V聚焦4h，以10%三氯乙酸固定。

2 结果

2.1 中国明对虾肝胰脏蛋白酶的分离纯化

中国明对虾肝胰脏经匀浆、抽提、30%和60%饱和度硫酸铵分级分离、透析离心后得到蛋白酶粗酶制剂。进一步经过Sephadex G-100分子筛柱层析分离纯化(见图1)，出现3个蛋白质吸收峰，但只有第二个蛋白峰周围具有蛋白酶活性，收集酶活力峰；再经DEAE-32纤维素离子交换柱层析分离(见图2)，从NaCl洗脱曲线分析，在0.25 mol/L NaCl下蛋白酶开始洗脱出来。各步分离纯化结果见表1，最终得到纯化倍数22.11，比活力为96.752 U/mg的蛋白酶制剂，经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一蛋白质成分(见图3a)，说明该酶制剂已达电泳纯。

图1 中国明对虾肝胰脏蛋白酶经Sephadex G-100层析的洗脱曲线

图2 中国明对虾肝胰脏蛋白酶经DEAE-32层析的洗脱曲线

2.2 蛋白酶纯度鉴定和分子量测定

纯化后的蛋白酶制剂进一步经SDS-PAGE电泳检测(见图3b)，结果表明：酶制剂中杂蛋白已被除去，获得了单一纯的蛋白酶制剂。从SDS-PAGE电泳图谱求各标准蛋白的相对迁移率Rf，以6种标准蛋白的Rf对相应分子量的对数lgMw作图(见图4)，回归一直线，直线方程为：y=-1.547x+5.187，根据蛋白酶的Rf，求得蛋白酶亚基分子量为36.3 kDa。

用Sephadex G-100凝胶层析法测定了蛋白酶的分子量，以5种标准蛋白的洗脱体积(Ve)对蛋白质分子量的对数(lgMw)作图(见图5)，得直线方程为：y=-0.012x+6.016；蛋白酶通过凝胶柱层析后的洗脱体积Ve为84 mL，求得蛋白酶的分子量为100.9 kDa。

2.3 蛋白酶等电点的测定

用等电聚焦电泳法测定了蛋白酶的等电点，以凝胶长度L对pH作图(见图6)，得直线方程为：y=1.08x+2.58。试验表明：蛋白酶的电泳条带距离正极为6.55 cm，求得中国明对虾蛋白酶等电点pI=9.65。

表1 中国明对虾肝胰脏蛋白酶的分离纯化

图3 蛋白酶经PAGE(a)及SDS-PAGE(b)图谱

2.4 蛋白酶最适pH与酸碱稳定性

考察了蛋白酶在不同pH下的酶活力大小，(见图7a)，蛋白酶催化酪蛋白水解的最适pH为8.0，偏弱碱性；进一步研究了4 ℃下蛋白酶经不同pH的Tris-HCl缓冲液处理1 h后的剩余酶活力(%)，分析酶的酸碱稳定性范围(见图7b)。结果显示：蛋白酶在pH=5.0～10.0时相对稳定，经pH=11.6缓冲液处理后酶活力还剩78.5%，而pH<5.0时处理酶失活加速，说明该蛋白酶对酸敏感，较耐碱，结合其是偏碱性的(pI=9.65)，可推测中国明对虾蛋白酶为碱性蛋白酶。

图4 SDS-PAGE测定蛋白酶亚基分子量

2.5 蛋白酶最适温度与温度稳定性

研究了温度对蛋白酶酶活力的影响(见图8a)。结果显示：温度对蛋白酶活力的影响曲线呈典型的钟罩型，酶催化酪蛋白水解的最适温度为65 ℃，65 ℃以上随温度升高剩余酶活力(%)不断下降，当温度达到90 ℃，酶活力只剩15.9%；进一步研究蛋白酶在不同温度下热处理1 h后的剩余酶活力(见图8b)，表明酶只在20～45 ℃之间具有较好的热稳定性；55 ℃下处理1 h酶剩余活力为36.5%，80 ℃下处理1 h酶接近失活，说明中国明对虾蛋白酶对热变化敏感。

图5 Sephadex G-100柱层析测定中国明对虾肝胰脏蛋白酶的分子量

图6 凝胶等电聚焦法测定中国明对虾肝胰脏蛋白酶的等电点

2.6 蛋白酶水解底物酪蛋白的动力学参数测定

以酪蛋白为底物，在1.0～5.0 mg/mL浓度范围内，测定不同底物浓度下蛋白酶的酶活力。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法(见图9)，得到1条直线，直线方程为：y=16.750x+3.659。求得Km为4.578 mg/mL，Vmax为0.273 U/min。

2.7 金属离子对蛋白酶活力的影响

研究了9种金属离子对蛋白酶活力的影响(见表2)。结果表明：100 mmol/L的Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Co2+和Zn2+可分别使蛋白酶活力丧失22.69%、30.70%、59.90%、71.07%、82.33%和96.88%，Mg2+对酶活力基本没有影响，Fe2+对蛋白酶活力则表现为较强的激活作用，5 mmol/L Fe2+可使酶活力提高155.68%；Hg2+对蛋白酶有强烈的抑制作用，10 mmol/L Hg2+可使蛋白酶活力完全丧失。研究了金属蛋白酶类抑制剂EDTA在0～10 mol/L浓度范围内对蛋白酶的影响，结果表明：EDTA对蛋白酶活力没有影响，说明中国明对虾肝胰脏蛋白酶的活性中心不含有金属离子，为非金属蛋白酶。

(a:最适pH;b:酸碱稳定性。a: optimum pH； b: pH stability.)图7 pH对中国明对虾肝胰脏蛋白酶活力的影响

(a：最适温度;b：热稳定性。a: optimum temperature； b: temperature stability.)图8 温度对中国明对虾肝胰脏蛋白酶活力的影响

图9 中国明对虾肝胰脏蛋白酶催化酪蛋白水解的Lineweaver-Burk双倒数图

3 讨论

3.1 中国明对虾肝胰脏蛋白酶的分离纯化

虾的肝胰脏、肠道等消化器官中含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等多种蛋白酶，但通过多步骤分离纯化后获得的蛋白酶组分往往很少。本试验通过多级分离，2次柱层析色谱均只有1个酶活力峰，得到比活力为96.752 U/mL的纯酶。潘滨等[8]在从凡纳滨对虾虾头分离纯化蛋白酶中，经凝胶层析和离子交换层析分离均只得到1个蛋白酶活力峰。而杭虞杰等[9]从南极磷虾(Antarctickrill)中分离纯化蛋白酶，先后经阴离子交换层析和凝胶层析，最后也只得到1个酶活力峰，SDS-PAGE电泳显示1条谱带；Guizani等[1]在分离纯化克氏原鳌虾(Procambarusclarkii)肝胰脏类胰蛋白酶时采用30%～70%的饱和硫酸铵分级分离，经Sephadex G-100和DEAE-纤维素2柱层析纯化，得到1个蛋白酶活力峰经SDS-PAGE电泳只显示1条蛋白谱带，与本试验结果相似。

表2 金属离子对中国明对虾肝胰脏蛋白酶活力的影响

3.2 中国明对虾肝胰脏蛋白酶的相对分子量

不同虾类蛋白酶亚基分子量不同。中华管鞭虾[7]蛋白酶分子量为24.5 kDa，酶蛋白只由1个亚基组成；Johnston等[16]从东方扁虾(Thenusorientalis)消化腺中分离到亚基分子量为35 kDa的胰蛋白酶，而南极磷虾[9]蛋白酶亚基分子量为28.0 kDa；野生红虾(Pleoticusmuelleri)[2]在虾蜕皮期间肝胰脏出现12种分子量(16.6～53.1 kDa)不等的蛋白酶亚基，在蜕皮后还分离到1个大分子量(65.3 kDa)的蛋白亚基，这些蛋白亚基都具有胰蛋白酶性质。而本试验中国明对虾蛋白酶亚基分子量为36.3 kDa，根据凝胶层析法测定的蛋白酶相对分子量(100.9 kDa)，推断该酶是由3个相同亚基组成。酶分子量相对较大，这应该是虾长期适应生存的环境所形成的种属特性。

3.3 pH对中国明对虾肝胰脏蛋白酶的影响

pH对虾类蛋白酶影响的试验结果表明：中国明对虾蛋白酶最适反应pH为8.0，酸碱稳定性范围宽，在pH为5.0～10.0内处理1 h酶活力还维持在84%以上，pI=9.65。这与南极磷虾[9]蛋白酶的最适pH相同，而中国龙虾(Panulirusstimpsoni)[17]肝胰脏类胰蛋白酶最适pH为8.8，这些虾蛋白酶的最适pH值均偏碱性，一般胰蛋白酶反应最适合pH在7.0～9.0[18]。南极磷虾[9]蛋白酶在pH为7.0～9.5范围内稳定，利用粗酶液研究的中国对虾(Penaeuschinensis)[19]蛋白酶也在pH为7.0～10.0内稳定。中国明对虾适宜在pH为7.8～9.3的水体中生长[20]，也在虾蛋白酶的酸碱稳定范围内。

此外，Sainz等[21]从凡纳对虾(Penaeusvannamei)消化腺中分离到3种类胰蛋白酶组分，pI分别为3.0、3.5和4.5；克氏原鳌虾[1]肝脏类胰蛋白酶的pI=3.0；而中国明对虾蛋白酶pI偏碱性，因此推断中国明对虾蛋白酶是1种碱性蛋白酶。这与孔繁东等[19]研究的中国对虾消化腺蛋白酶也是1种碱性蛋白酶的结果一致，可能是中国明对虾适宜在偏碱性的水体中生长的原因之一。根据本试验酶活力检测方法以及从分离到蛋白酶的最适pH和等电点分析，试验获得的蛋白酶可能是1种类胰蛋白酶。

3.4 温度对中国明对虾肝胰脏蛋白酶的影响

不同虾类蛋白酶的最适温度不同。中国明对虾蛋白酶的最适温度为65 ℃，与斑节对虾(Penaeusmonodon)(A,B,C 3组分)(65 ℃)相同[22]，大于南极磷虾蛋白酶(50 ℃)和南美白对虾(Penaeusvannamei)丝氨酸蛋白酶的最适温度(40 ℃)[9,23]。试验还表明：55 ℃下处理1 h后中国明对虾蛋白酶活力会丧失63.5%，而凡纳滨对虾蛋白酶在60 ℃下处理1 h，酶活性仅残留4.7%[8]，均呈现对热的不稳定性中。然而，中华管鞭虾蛋白酶在60 ℃放置1 h后酶活性仍保持在60%以上[7]，说明不同虾类蛋白酶的热稳定性不同。中国明对虾生长的适宜水温为18～30℃，耐高温能力差[20]，而对虾肝胰脏蛋白酶较适温度并不在此范围内，说明中国明对虾蛋白酶常在低于最适温度值下进行作用的,具有低温适应性，水温高时酶活性也高，因此在不同水温下应根据消化酶的活性来决定饵料成分的配比及投饵量。

3.5 金属离子对中国明对虾肝胰脏蛋白酶的影响

本试验研究表明：Ca2+等7种金属离子对中国明对虾蛋白酶有不同程度的抑制作用，Hg2+抑制作用最强，Mg2+对酶活力没有影响，Fe2+则有较大的激活作用。这些金属离子对不同虾类蛋白酶的效应存在差异，Mg2+，Zn2+，Cu2+和Hg2+对克氏原鳌虾[1]肝胰脏类胰蛋白酶有不同程度的抑制作用；而Ca2+对凡纳滨对虾[8]蛋白酶有激活作用，Fe2+、Ba2+和Zn2+表现为较强抑制作用；Mg2+对中华管鞭虾蛋白酶有激活作用[7]，但Ca2+、Ba2+和Fe2+对其影响不大。说明虾生活的水环境中金属离子或在配合饲料中添加的矿物质均可能对蛋白酶活力产生影响，在配合饲料中添加矿物质时要注意控制添加量，以免使中国明对虾蛋白酶的活性降低，影响对蛋白质的消化吸收。目前对对虾配合饲料中微量元素的添加量还没有专门系统的研究，具体的添加量应根据饲养试验来进一步确定。

EDTA是金属蛋白酶类的抑制剂，凡纳滨对虾[8]和中华管鞭虾[7]消化腺蛋白酶均受到EDTA的抑制，为金属蛋白酶类；但对南极磷虾蛋白酶基本没有影响[9]，本研究表明EDTA对中国明对虾蛋白酶活力没有影响，可推断该酶为非金属蛋白酶。

总之，虾蛋白酶活性的发挥还是受到虾体内外诸多因素制约，虾生存的水体温度、环境pH、体内外离子浓度及饲料中矿物质成分等发生改变，均会影响着虾消化道蛋白酶的活性。

[1] Guizani N, Marshall M R, Wei C I. Purification and characterization of a trypsin-like enzyme from the hepatopancreas of crayfish(Procambarusclarkii) [J]. Comp Biochem Physiol Part B: Biochem Mol Biol, 1992(1): 71-82.

[2] Fernández Gimenez A V, García-Carreo F L, Navarrete Del Toro M A, et al. Digestive proteinases of red shrimpPleoticusmuelleri(Decapoda, Penaeoidea): partial characterization and relationship with molting [J]. Comp Biochem Physiol Part B: Biochem Mol Biol, 2001, 130(3): 331-338.

[3] 姜松， 杨其彬， 黄建华， 等. 蛋白水平对不同斑节对虾家系生长与消化酶活性的影响 [J]. 海洋渔业, 2013, 35(1): 86-94.

[4] 孟庆武， 张秀梅， 张沛东， 等. 饥饿对凡纳滨对虾仔虾摄食行为和消化酶活力的影响 [J]. 海洋水产研究, 2006, 27(5): 44-50.

[5] 黄凯， 杨鸿昆， 战歌， 等. 盐度对凡纳滨对虾幼虾消化酶活性的影响 [J]. 海洋科学， 2007, 31(3): 37-40.

[6] 杨奇慧， 周歧存， 马丽莎， 等. 凡纳滨对虾幼体胃蛋白酶和类胰蛋白酶活力的研究 [J]. 海洋科学， 2005, 29(5): 6-9.

[7] 杨文鸽， 薛长湖， 徐大伦， 等. 中华管鞭虾(Solenoceracrassicornis)蛋白酶的纯化及其生化特性研究 [J]. 海洋与湖沼, 2006, 37(1): 47-52.

[8] 潘滨， 谢月霞， 戴君勇. 凡纳滨对虾蛋白酶的分离纯化及生化特性 [J]. 水产科学， 2009, 28(12): 763-766.

[9] 杭虞杰， 李学英， 杨宪时， 等. 南极磷虾蛋白酶分离纯化及部分性质研究 [J]. 食品与发酵工业, 2011, 37(10): 92-95.

[10] Cao W H, Zhang C H, Hong P Z, et al. Response surface methodology for autolysis parameters optimization of shrimp head and amino acids released during autolysis [J]. Food Chem, 2008, 109(1): 176-183.

[11] 孙建明， 刘亚杰， 周遵春. 不同生长时期中国对虾蛋白酶、脂肪酶活性变化的研究 [J]. 水产科学， 1995, 14(2): 11-13.

[12] 施特尔马赫· B. 酶的测定手册 [M]. 钱嘉渊， 译. 北京： 中国轻工业出版社, 1992： 253-254.

[13] Bradford M M. A rapid and sensitivity method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding [J]. Analyt Biochem, 1976, 72(2): 248-254.

[14] Xie X L, Chen Q X, Lin J C, et al. Purification and some properties of β-N-Acetyl-D-glucosaminidase from prawn(PenaeusVannamei) [J]. Mar Biol, 2004, 146: 143-148.

[15] 高英杰， 郝林琳. 高级生物化学实验技术 [M]. 北京： 科学出版社, 2011： 1-231.

[16] Johnston D, Hermans J M, Yellowlees D. Isolation and characterization of a trypsin from the slipper lobster,Thenusorientalis(Lund) [J]. Arch Biochem, 1995, 324(1): 35-40.

[17] 姜永华， 颜素芬. pH值对中国龙虾消化酶活力的影响 [J]. 动物学报， 2008, 54(2): 317-322.

[18] 王萍， 吴燕燕， 李来好， 等. 虾类胰蛋白酶的研究进展 [J]. 生物技术通报， 2011(2): 43-47.

[19] 孔繁东， 苑艳纳， 徐杨. 中国对虾蛋白酶性质的研究 [J]. 食品工业， 2012, 33(5): 74-76.

[20] 夏爱军， 姚蕾. 对虾人工养殖技术讲座 [J]. 水产养殖， 1999 (1): 30-32.

[21] Sainz J C, García-Carreňo F L, Hernández-Cortés P.Penaeusvannameiisotrypsins: purification and characterization [J]. Comp Biochem Physiol Part B: Biochem Mol Biol, 2004， 138(2): 155-162.

[22] Jiang S T, Moody M W, Chen H C. Purification and characterization of proteases from digestive tract of grass shrimp(Penaeusmonodon) [J]. J Food Sci, 1991, 56(2): 322-326.

[23] 翁凌， 李腾， 阴利华， 等. 南美白对虾丝氨酸蛋白酶的分离纯化及性质研究 [J]. 集美大学学报: 自然科学版， 2010, 15(4): 272-278.

责任编辑 高 蓓

Isolation,Purification and Properties of Protease fromFenneropenaeuschinensis

LIN Jian-Cheng, ZHENG Yun-Zhong, MIN Zhi-Yong

(School of Environment & Biological Engineering, Putian University, Putian 351100, China)

The protease was purified from the hepatopancreas ofFenneropenaeuschinensisby ammonium sulfate fractionation, then chromatographed on Sephadex G-100 followed by DEAE-cellulose(DE-32) column. The purified enzyme determined to be homogeneous by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and SDS-PAGE. The specific activity of the purified enzyme was 96.752 U·mg-1. Enzyme molecular weight was determined to be 100.9 kDa; it contained three subunits of the same mass (36.3 kDa). The pI value was calculated to be 9.65 by isoelectric focusing. The optimum pH and optimum temperature of the enzyme for the hydrolysis of casein(enzyme substrate) were determined to be pH 8.0 and 65 ℃, respectively. TheKmandVmvalues were determined to be 4.578 mg/mL and 0.273 U/min by plot of Lineweaver-Burk, respectively. The stability of the enzyme was investigated, and the results showed that the enzyme was stable in a pH range from 5.0 to 10.0 and at temperatures<45 ℃. The stability of enzyme dropped rapidly at temperatures>50 ℃. The effects of metal ions on the enzyme were also studied. Mg2+had no influence on enzyme activity. Fe2+activated the enzyme, while Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+and Hg2+showed various degrees of inhibitory effects on the enzyme. Hg2+inhibited the enzyme most strongly, when its concentration reached 10 mmol·L-1, enzyme activity completely ceased. EDTA had no influence on the enzyme indicating the protease was nonmetallic enzyme.

Fenneropenaeuschinensis; protease; isolation and purification; enzyme properties

福建省高校服务海西重点建设项目(2008HX02)；福建省区域科技重大项目(2009N3002)资助

2014-03-26；

2014-05-21

林建城(1966-)，男，教授，从事海洋生物酶学的研究工作。E-mail: ptljc660402@sina.com

Q556.1

A

1672-5174(2015)06-057-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140075