柠檬酸和EDTA对cyclinD1和Td T抗原修复的应用比较

陈晶晶，陈 炯

(安徽省立医院病理科，安徽合肥 230001)

免疫组织化学技术是用已知抗体或抗原检测组织细胞中的未知抗原或抗体的技术，能将形态、代谢和功能密切结合起来，具有操作简单、敏感性高、特异性强等优点，广泛地应用于病理诊断［1]。但常规福尔马林固定、石蜡包埋组织过程中会引起蛋白内和蛋白间亚甲基桥的桥连，导致许多抗原决定簇被封闭，使表达反应微弱，染色效果不佳，从而影响诊断的准确性，因此抗原修复技术是免疫组化实验中的重要操作步骤［2]。结合实践工作发现在陈旧恶性淋巴瘤标本中，一些核表达的标记物对抗原修复方式和修复溶液的选要求很严格，常规的热修复结合低pH溶液很难达到预想的染色效果［3]，尤其是套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)核标记cyclinD1和淋巴母细胞淋巴瘤(lymphoblastic lymphomas，LBL)核标记TdT。这两种核型标记物是诊断该类肿瘤的特异性标记物，所以合理的搭配抗原修复条件，尽量做到标准化对淋巴瘤的病理分型变的尤为重要。本次实验采用高压修复法，比较 pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和 pH 9．0 Tris/EDTA三种修复液对cyclinD1和TdT免疫组化结果产生的影响。

1 材料与方法

1．1 组织来源 收集本院病理科2005—2010年常规活检切除的淋巴结陈旧标本104例(MCL 56例和LBL 48例)，标本固定均用10%中性缓冲福尔马林，常规脱水、透明、浸蜡和包埋，连续切片6～8张(不同检测条件所需)，并且每张片子上放置阳性和阴性对照各一张，切片厚1～2μm，60℃烤箱，烤片过夜。

1．2 试剂及显色试剂盒 抗体均采用北京中杉金桥生物公司，即用型 cyclinD1(EP12)和 TdT(SEN28);抗原修复溶液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA和 pH 9．0 Tris/EDTA);二抗及 DAB为北京中杉PV-6000 EnVision TM检测试剂盒。

1．3 仪器设备 抗原修复高压锅(北京中杉金桥)，塑料染色架。

1．4 实验方法和过程 按缓冲液pH值高低，将高压锅中各装入不同pH值的缓冲液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和 pH 9．0 Tris/EDTA)加热至沸腾，将脱蜡水化后的切片装在耐热高压塑料染色架中，再放入高压锅中，盖严锅盖，再加热至喷汽继续加热，即达到工作压力及温度。计时2．5 min，停止加热，室温自然降温，打开锅盖取出切片，蒸馏水洗净切片后，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性8 min，PBS洗，每张切片上滴加相应的一抗。室温下孵育2～3 h，PBS洗，二抗室温下孵育30 min，PBS洗，DAB显色，光镜下控制。自来水充分冲洗，苏木素复染、分化、蓝化、脱水、透明，中性树胶封片。每张切片都设有阳性和阴性对照。

1．5 结果判定 cyclinD1和TdT定位于细胞核，每张切片选10个高倍视野，每高倍视野记数100个正常细胞或癌细胞，用半定量积分法判断结果先按染色强度打分:0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度依背景着色进行对比;再按阳性细胞所占百分比打分:0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11% ～50%，3分为51% ～75%，4分为＞75%。两者计分之和所得总分进行结果判定。0～1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)［4]。

1．6 统计学处理 采用SPSS 17．0统计软件，等级资料运用秩和检验进行统计分析。

2 结果

免疫组化染色结果，EDTA较柠檬酸盐缓冲液，56例MCL中40例cyclinD1表达强度随着pH值的升高而增强(见图1～3)，阳性率从71%提高到82%，其中6例用pH 6．0 Citrate修复后不表达，而用pH 9．0 Tris/EDTA修复后强弱不等的表达(见表1)，按实际结果采用等级资料两样本配对秩和检验比较柠檬酸和pH 9．0 Tris/EDTA缓冲液对cyclinD1抗原修复结果，二者差异有统计学意义(P＜0．05)(见表2);另外48例LBL中42例TdT表达强度随着pH值的升高而增强(见图4～6)，阳性率从88%提高到95%，其中4例用pH 6．0 Citrate修复后不表达，而用高pH值EDTA修复后强弱不等的表达(见表1)，按实际结果采用等级资料两样本配对秩和比较柠檬酸和pH 9．0 Tris/EDTA缓冲液对TdT抗原修复结果，二者差异有统计学意义(P＜0．01)(见表3)。

表1 两种抗体在三种不同抗原修复液中的免疫组化染色结果比较/%

表2 柠檬酸盐和EDTA(pH9．0)缓冲液对cyclin D1抗原修复的比较

表3 柠檬酸盐和EDTA(pH9．0)缓冲液对Td T抗原修复的比较

3 讨论

免疫组化技术中保证实验操作流程的标准化是个非常重要的问题。很多因素都会影响免疫组化染色结果的好坏，其中抗原修复是非常关键的步骤，修复方法是否得当，直接影响抗体的表达，影响病理诊断的准确性和患者治疗方案的选择的［5]。当活检组织经过福尔马林和石蜡包埋后，许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得抗原决定簇被封闭。同时，甲醛的聚合作用使蛋白质分子间相互交联形成了大分子网络，也使抗原决定簇被掩盖，使抗原与抗体的结合点减少，从而令抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱的［6]，必须进行抗原修复，以最大限度地暴露其被遮盖的抗原，所以高压修复配上合理的修复液可以改善难以检测的细胞核阳性抗原的染色结果。cyclinD1是一种重要的细胞周期调节因子，在控制细胞从G1期进入S期起重要作用，它可以和CD4构成复合物，并与 Rb基因(retinoblastoma gene)产物结合，同时将后者磷酸化，继而释放转录因子E2F，最终刺激细胞的生长并导致细胞周期异常［7]。68% ～82%的 MCL患者染色体(11;14)(q13;q32)易位，导致细胞周期蛋白D1的PARAD(parathyroid adenomatosis)基因过度表达，促进cyclinD1蛋白的合成和过度表达，在其他形态相近的淋巴瘤均不具有此特点的［8]，是MCL最特异的免疫标记，因此cyclinD1主要用于MCL的诊断及鉴别诊断［9]。末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)是一种 DNA聚合酶．它可以不需要模板的存在而催化游离脱氧核苷酸随机地插入到 DNA链3＇羟基末端［10]。该酶参与淋巴细胞发育过程中的免疫球蛋白和T细胞受体基因重排，在淋巴前体细胞中高表达，包括T和B(前期)淋巴细胞和淋巴母细胞，其表达有助于LBL的明确诊断，但也存在少数阴性的［11]。我们在诊断恶性淋巴瘤的过程中，这两种特异性免疫指标非常的重要，但我们发现在蜡块组织中染色阳性率达不到文献报道的阳性率(MCL中cyclinD1阳性率68% ～82%;LBL中TdT阳性率96%)［12－13]。按我们实验室常规标记的抗原修复方法和修复溶液，结果有时会有争议，出现弱表达或不表达。分析原因可能是免疫组化组织前期处理和操作过程不当所致，包括标本活检后没有及时固定，固定的时间和量未达到要求;脱水不彻底;免疫组化操作中出差错等，很多原因都会导致假阴性。我们通过反复实验排除以上诸多因素，调节免疫组化操作中的可变因素发现恶性淋巴瘤的cyclinD1和TdT抗原在高压修复方法、不同的修复液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和pH 9．0 Tris/EDTA)的条件下，核表达的强度随着修复液pH值的升高而升高，甚至用酸性修复液抗原表达是阴性，再用EDTA修复抗原表达阳性。这说明高pH值的抗原修复液更容易暴露核的抗原决定簇，可能蛋白质是两性物质，不同pH值的抗原修复液对裂解醛—氨基之间的交联或蛋白质之间的交联的作用不同，抗原决定簇暴露的程度也不同，使标记效果不同;其次用EDTA作抗原修复液，EDTA可与Ca2+形成螯合双价金属离子盐(螯合剂)，螯合剂具有稳定性，可消除Ca2+与蛋白质形成牢固的复合物，消除许多羟基(－OH)、羧酸根(－COOH)、磷酸根 PO43－的影响，即消除福尔马林固定产生的不利因素;但具体的机制有待进一步的研究。因此，对于恶性淋巴瘤核表达标记物cyclinD1和TdT染色最好选用以EDTA为抗体修复液，进行高压修复，以获得最佳的效果，提高cyclinD1和TdT阳性检出率，为临床病理诊断良、恶性淋巴瘤提供确切的证据。

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