高效液相色谱法测定银花感冒冲剂中绿原酸含量

陈 述 席桂同

(中国中医科学院西苑医院，北京，100091)

中药研究

高效液相色谱法测定银花感冒冲剂中绿原酸含量

陈 述 席桂同

(中国中医科学院西苑医院，北京，100091)

目的:建立测试银花感冒冲剂中绿原酸含量的高效液相方法，并对此方法进行系统的方法学验证，以确保应用该方法测试的结果准确、可靠。方法:采用色谱柱:Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent，美国)，流动相:甲醇-0.5%磷酸溶液(15∶85)，检测波长为327 nm。结果:绿原酸在25～800 μg/mL范围内线性关系良好，得到线性回归方程为Y=27.88X+2.128，相关系数为0.999 8(n=6);低、中、高浓度精密度的RSD值分别为0.59%、0.58%、0.44%;重复性RSD为0.26%;低、中、高浓度的加样回收率分别为99.24%、99.43%、99.75%;供试品溶液室温放置8 h稳定，RSD为0.29%。结论:本方法测定银花感冒冲剂中绿原酸的含量准确、可靠，操作简单、用时短，可用于银花感冒冲剂中绿原酸的含量测定。

高效液相色谱法;绿原酸;银花感冒冲剂;含量测定

银花感冒冲剂是临床常用的感冒药，由金银花、连翘、防风、桔梗、甘草五味药制成，具有清热，解表，利咽功效，临床主要用于用于感冒发热、头痛、咽喉肿痛[1]。绿原酸是金银花的主要有效成分之一，具有消炎抗菌、抗氧化、抗衰老、利胆降压、抗肿瘤等药理作用，是银花感冒冲剂质量控制的重要指标之一[2]。笔者采用高效液相方法建立了实用、准确、可靠的绿原酸含量检测方法，通过方法学验证，具体叙述如下。

1 实验材料

1.1 仪器与设备 岛津265型紫外分光光度计;Agilent 1290型高效液相色谱仪(配有脱气机、自动进样器、恒温箱、液相色谱泵、柱温箱及荧光检测器)，由Chemstation化学工作站系统控制(Agilent，德国);METTLER TOLEDO AB135-S型十万分之一天平(METTLER，瑞士);XW-80A涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂);TGL16M型冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司);AHL-2001-P痕量型分析型超纯水机(艾科浦，重庆颐洋企业发展有限公司)。

1.2 试药与材料 绿原酸对照品:由中国药品生物制品检定研究院提供，批号:110753-200413;银花感冒冲剂:由内蒙古某股份有限公司提供，批号:140106、140113、140120、140127、140210;磷酸:天津科密欧化学试剂有限公司，分析纯，批号:130315;甲醇:美国Tedia公司，色谱纯，批号:1202257;纯水:自制去离子超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent，美国);保护柱:Gemini C18(4 mm×3.0 mm，10 μm，Phenomenex，美国);流动相:甲醇-0.5%磷酸溶液(15∶85);流速:1.2 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:5 μL。检测波长327 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取绿原酸对照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加适量流动相溶解后，再用流动相稀释至刻度线，摇匀，即得浓度为1 mg/mL的绿原酸对照品储备溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.2.2 供试品溶液的配制 取银花感冒冲剂10包，精密称定，研碎，精密称取适量(约1 000 mg)，置于带塞锥形瓶中，加入约20 mL 50%甲醇水溶液，超声处理0.5 h，充分摇匀，冷却至室温，完全转移至50 mL的容量瓶中，再用50%甲醇水溶液定容至刻度线，摇匀。进样前用0.45 μm的微孔滤膜过滤后，取续滤液进样5 μL。

2.2.3 阴性对照液 制备缺少金银花的空白银花感冒冲剂(金银花成分以基质代替，其余处方同银花感冒冲剂)，再按“2.2.2供试品溶液的配制”项下方法，配制成阴性样品溶液。

2.3 检测波长的选择 以流动相作为空白对照，将绿原酸对照液和供试品溶液在紫外分光光度计上扫描，扫描区间为200～350 nm，结果得出，绿原酸在327 nm处显示有最大吸收。因此，选择327 nm作为检测波长。

2.4 系统适用性与专属性考察 分别取绿原酸对照品溶液、阴性对照液、供试品溶液适量，在上述色谱条件下进样20 μL。记录并观察3份溶液的色谱图。结果得出，绿原酸峰的理论塔板数不低于3 000，阴性对照液中无干扰峰干扰测定，对照液与供试液中绿原酸峰的保留时间一致，绿原酸峰周围无干扰峰，基质不干扰测定，本方法专属性好。典型色谱图如下图1所示。

2.5 线性关系考察 精密移取浓度为1 mg/mL的绿原酸对照品储备溶液适量，用流动相逐级稀释成含绿原酸浓度为800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL等6个浓度级别的系列对照品工作溶液，进样5 μL。记录各浓度绿原酸对照液的峰面积。结果得出，绿原酸在25～800 μg/mL范围内线性关系良好，以绿原酸浓度为横坐标，所得峰面积为纵坐标，得线性回归方程为Y=27.88X+2.128，相关系数为0.999 8(n=6)。

图1 专属性考察图谱

2.6 精密度考察 配制低、中、高浓度(绿原酸浓度为50 μg/mL、200 μg/mL、640 μg/mL)的对照品工作溶液，每个浓度平行配制5份，分别进样5 μL，记录峰面积，见表1。结果得出，低、中、高浓度绿原酸的RSD值分别为0.59%、0.58%、0.44%，表明精密度良好。

表1 精密度考察结果

2.7 重复性考察 取同一批次的供试品6份，按照“2.2.2”项下方法配制成6份供试品溶液，进样5 μL，记录峰面积，见表2。结果得出绿原酸峰面积的RSD值为0.26%，表明该方法重现性良好。

表2 重复性考察结果

表3 加样回收率考察结果

2.8 加样回收率考察 精密移取同一已知(75.65 μg/mL)的供试品溶液1mL，平行5份，分别加入低、中、高浓度(绿原酸浓度为50 μg/mL、200 μg/mL、640 μg/mL)的对照品工作溶液1mL，混匀，进样，记录峰面积，见表3。本实验所得绿原酸低、中、高浓度的加样回收率分别为99.24%、99.43%、99.75%，RSD分别为1.2%、0.8%、0.5%。

2.9 稳定性考察 取同一份供试品溶液(75.65 μg/mL)，分别在室温下放置0 h、4 h、6 h、8 h后测定，记录色谱峰，见表4。结果得出，在室温下放置8 h后测定的RSD值为0.29%，可说明绿原酸供试品溶液室温放置8 h稳定。

表4 室温放置稳定性考察结果

2.10 样品含量测定 取5个批次(批号分别为140106、140113、140120、140127、140210)的银花感冒冲剂，按上述“2.2.2”项下方法配制成供试品溶液，取配制好的供试品溶液，进样5 μL，每个批次平行测定3次，记录峰面积，采用外标法计算银花感冒冲剂中绿原酸的含量，含量计算结果见表5。5个批次的银花感冒冲剂中绿原酸的含量分别为3.749 mg/g、3.751 mg/g、3.746 mg/g、3.746 mg/g、3.747 mg/g。

表5 含量测定结果

3 讨论

银花感冒冲剂是由金银花、连翘、防风、桔梗、甘草五味药制成，具有清热，解表，利咽功效，临床主要用于用于感冒发热、头痛、咽喉肿痛。方中金银花为君药，具有清热解毒、凉散风热的功效[3]。金银花中含有的化学成分很多，主要包括有机酸类、挥发油类、黄酮类、皂苷类等。有机酸类化合物是金银花最重要的化学组成部分，也是最主要的有效成分，包括绿原酸、异绿原酸、棕榈酸等[4]。绿原酸是其主要成分，是金银花抗菌消炎药效特征的有效成分。绿原酸不仅仅是金银花生药材的质量控制指标，也是含有金银花的中成药或制剂的质量控制指标。

目前绿原酸的测定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法、液质联用法等。2010版《中华人民共和国药典》中确定了金银花中绿原酸的高效液相测定方法，一些学者也进行了绿原酸的含量测定方法研究，并取得了很好的研究成果[6-10]。肖文平等[11]应用紫外分光光度法，对比分析对不同花期的金银花应用不同的提取方法所测得的金银花中绿原酸的含量，研究结果得出，乙醇回流法的提取效率高于超声提取，花苞期金银花中绿原酸的含量高于金银花原液。钟方晓[12]采用了紫外分光光度法和高效液相色谱法两种方法分别测定了金银花中绿原酸和异绿原酸的含量，研究发现，紫外分光光度法测得结果为绿原酸和异绿原酸的总含量，高效液相方法则能将二者的含量分开测定，实验数据证实，高效液相法所得绿原酸和异绿原酸的含量之和与紫外分光光度计测得的数据基本相符。说明紫外分光光度法不适宜单独测定绿原酸的含量[13-14]。

为了更方便快捷、准确有效的做好银花感冒冲剂的质量控制工作，笔者应用高效液相方法对银花感冒冲剂中绿原酸的含量进行了测定，对各项条件进行了摸索，最终确定了适宜的流动相，波长，供试品处理方法等条件，建立了一套高效、可靠的方法。流动相是应用甲醇-0.5%磷酸溶液(15∶85)，流速为1.2 mL/min，该色谱条件下，绿原酸峰型良好，能取得很好的分离度，绿原酸峰周围无干扰峰，无基质干扰测定。通过方法学验证得出结果，低、中、高浓度的精密度良好，RSD值分别为0.59%、0.58%、0.44%;重现性好，重现性RSD值为0.26%;该方法实验所得低、中、高浓度的加样回收率分别为99.24%、99.43%、99.75%。实验测得本次抽取的5个批次(批号分别为140106、140113、140120、140127、140210)的银花感冒冲剂中绿原酸的含量分别为3.749 mg/g、3.751 mg/g、3.746 mg/g、3.746 mg/g、3.747 mg/g。本研究结果与李建芳等人研究结果大体一致[2]，但本实验制剂中所含绿原酸的含量略高，这与制剂配方及金银花的类别，供试品的提取处理方法有一定的关系。

总之，本方法用于测定银花感冒冲剂中绿原酸的含量准确、可靠，操作简单、用时短，可用于银花感冒冲剂的含量测定，用于该制剂的质量控制。

[1]许佩兰.复方银花感冒颗粒质量标准的研究[J].内蒙古中医药，2011，30(9):114.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社，2010:205.

[3]李建芳，黄劲通.高效液相色谱法测定银花感冒冲剂中绿原酸含量[J].中国药业，2013，22(14):63-64.

[4]李锦燊，吴洪文.HPLC同时测定山银花中绿原酸和木犀草苷的含量[J].北方药学，2013，10(8):10-11.

[5]周惠燕，陈珏.金银花提取物中绿原酸含量测定[J].中国中医药信息杂志，2011，18(11):61-62.

[6]张莉，王学芳，李德华.HPLC法测定银花利咽片中绿原酸的含量[J].海峡药学，2011，23(11):68-70.

[7]张雷.抗感冒冲剂质量标准研究[J].辽宁中医药大学学报，2012，14(4):231-232.

[8]唐德智.HPLC测定银花感冒颗粒中绿原酸含量[J].中医药导报，2009，15(8):73-74.

[9]江帆，郭培果.HPLC法测定儿感口服液中绿原酸的含量[J].中国药房，2009，20(33):2600-2602.

[10]何兵，田吉，肖顺汉.HPLC测定楤木叶中绿原酸的含量[J].泸州医学院学报，2010，33(3):229-231.

[11]马彦芳.金银花中总黄酮的含量测定[J].青海科技，2007，14(4):29-30.

[12]钟方晓.高效液相及紫外分光光度法测定金银花中绿原酸和异绿原酸含量方法学比较[J].时珍国医国药，2005，16(3):212.

[13]邓育平.高效液相色谱法测定金银花含片中绿原酸含量[J].现代农业科技，2008(14):11-12.

[14]汪洪武，刘艳清.HPLC测定复方金银花颗粒中绿原酸与黄芩苷含量[J].中国药学杂志，2009，44(9):706-708.

(2014-04-26收稿 责任编辑：王明)

Determination of the Contents of Chlorogenic Acid in Yinhuaganmao Granules by HPLC

Chen Shu,Xi Guitong

(XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China)

Objective:To establish a high performance liquid phase method to measure the content of chlorogenic acid of Flos Lonicerae in Ganmao granules,and to ensure that the results are accurate and reliable by systematic methodology.Methods:The chromatographic column:Agilent TC-C18 column (4.6 × 150 mm,5 μ m,Agilent,American),a mobile phase of methanol:-0.5% phosphoric acid solution (15:85),the detection wavelength was 327 nm.Results:The chlorogenic acid in 25ug mL-1-800ug·mL-1linear relationship was good,the linear regression equation was Y = 27.88X+2.128,correlation coefficient was 0.999 8 (n = 6); low,high concentrations of RSD precision,values were 0.59%,0.58%,0.44%; repetitive RSD 0.26%; low,recoveries.The high concentration were respectively 99.24%,99.43%,99.75%; the test solution was placed at room temperature for 8 h,and RSD was 0.29%.Conclusion:This method for determination of the content of chlorogenic acid in Flos Lonicerae cold granule is accurate and reliable with simple operation and short time.It can be used for the determination of chlorogenic acid in Flos Lonicerae in Ganmao granules.

HPLC; Chlorogenic acid; Yinhuaganmao granules; Content determination

席桂同，主管药师，地址:北京市海淀区西苑医院药剂科，邮编：100091

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.026