基于蛋白质组学策略的肿瘤标记物筛选及作用机制

(大连医科大学 辽宁省高校蛋白质组学重点实验室，辽宁 大连116044)

邵淑娟

近年来，肿瘤已成为严重威胁人类健康的重大疾病。早期就诊的肿瘤患者5年生存率远远高于晚期就诊患者，因此，早期诊断、早期治疗已逐渐成为肿瘤防治研究的重中之重。深入认识肿瘤的发病原因和机制，发现用于早期诊断的肿瘤标志物是实现肿瘤早期诊治的关键，也是目前肿瘤基础研究和临床研究的热点。其中，以大规模高通量的蛋白质分析技术为研究手段，深入挖掘肿瘤发生发展过程中蛋白质表达的变化，为肿瘤蛋白质标志物的筛选、临床药靶的鉴定以及探讨肿瘤的分子机制提供了新思路和新途径。

1 蛋白质组学的主要研究策略

1994年，澳大利亚学者Wilkins 和Williams 等人首次提出了蛋白质组(proteome)的概念，其研究目的是系统分析生物体内蛋白质结构、功能以及相互作用的动态变化。随着技术的发展，研究的不断深入，蛋白质组学的概念和研究内容在不断发展深化。目前蛋白质组学分离鉴定中最常用的是“Top-Down”和“Bottom-up”技术。

1.1 基于胶的蛋白分离和鉴定技术

二维凝集电泳(two dimensional electrophoresis，2D-PAGE)技术是“Top -Down”技术的经典方法，其原理是根据蛋白质的等电点和分子量的不同而实现样品在聚丙烯酰胺胶上的分离。该技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点，可同时提供蛋白质等电点、相对分子量等信息，但对极酸或极碱的蛋白质、高疏水性蛋白质(如膜蛋白质)、低丰度蛋白质以及极大和极小分子量蛋白质的检测仍存在困难。

荧光双向差异凝胶电泳技术(fluorescence twodimensional differential gel electrophoresis，DIGE)改进了二维凝胶电泳技术存在的重复性和精确性差的问题。该方法将待比较的蛋白质样品用不同的荧光染料(Cy2、Cy3、Cy5)标记，并将所有样品等比例混合作为内标［1-4］。与传统的二维凝胶电泳技术相比，该方法减少了工作量，增强了定量的可靠性，提高了蛋白质定量的重复性和准确度。本研究小组利用该技术比较了肺癌和癌旁正常组织的蛋白表达差异，成功分离了75 个差异表达蛋白点，鉴定了413个差异蛋白，其中在肺癌组织中上调的蛋白质有204 个，下调的蛋白质有209 个［5］。随后，研究小组对这些鉴定的差异蛋白质进行了功能及其作用机制探讨，如环指蛋白19［6］、甘油醛三磷酸脱氢酶［7］、膜联蛋白A5［8］、果糖二磷酸醛缩酶A(ALDOA)［9］等。

1.2 基于色谱的分离和鉴定技术

由John Yates 等人引入蛋白质组学领域的多维液相色谱(multidimensional liquid chromatography，MudPIT)极大的提高了蛋白质的鉴定能力。该技术主要是基于“Bottom -up”技术，即将蛋白质用特定的蛋白酶消化为肽段后，利用肽段在强阳离子交换柱(SCX)和反向柱(RP)上的保留能力的不同进行二维液相色谱分离，分离的肽段再利用在线的串联质谱进行鉴定。该方法由于质谱鉴定效率高、自动化程度好而逐渐成为蛋白质组学研究的主流方法。在肿瘤蛋白质组学研究中，最常见的就是研究疾病与对照组之间的差异表达蛋白质。基于稳定同位素标记的定量技术可实现多个样品之间的精确定量比较［10］，目前比较成熟的技术有化学标记(ICAT、二甲基化标记［11］)、代谢标记(SILAC)［12］及等重同位素标签标记定量法(iTRAQ)［13］等。ICAT 技术主要共价标记半胱氨酸，因此无法定量不含半胱氨酸的蛋白和肽段［14］。二甲基化标记法利用醛和氰硼氢化钠及各自的同位素形式标记肽段所有活性氨基。该方法具有反应条件温和、快速高效、无明显副反应、价格低廉等优点［15］。有研究者利用原位二甲基标记技术成功实现了肝癌患者和健康人血清中内源性磷酸肽的相对定量分析［16］。代谢标记是在细胞或生物体成长过程加入含有稳定同位素标记的培养基，完成细胞或生物体标记的方法［17］。该方法易于实现、定量准确度高，但实验成本较高且难以用于人的组织样品及体液的分析。有研究利用含15N 标记的蛋白质喂养小鼠，使整个老鼠实现同位素标记，发现了多种长寿命蛋白质［18］。iTRAQ 技术标记蛋白质的N 端和赖氨酸侧链，基本可以标记所有蛋白质［19］。目前商品化iTRAQ 试剂盒最多可以实现8个样品的定量分析，但其价格相对比较昂贵，且标记时容易受蛋白缓冲体系和杂蛋白的影响。Lv 等［20］利用iTRAQ 技术比较了结肠癌患者和健康人组织，发现了68 个差异蛋白质，其中多个差异蛋白质与肿瘤的发生发展密切相关。

2 基于蛋白质组学的肿瘤标记物筛选生物样本

生物标志物(biomarker)是指“一种可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子”。在肿瘤学领域，寻找早期检测、诊断分型、治疗监测和预后的生物标志物一直是近年来的研究热点。目前常用的生物样本有以下几种。

2.1 血液(含血清、血浆)

血液由于便于实验取材和临床应用、易于利用ELISA 等手段实现检测的优点，一直是肿瘤标记物筛选的理想生物样本。但血液的成分复杂、蛋白质丰度动态范围大、低丰度的与肿瘤密切相关的分泌蛋白质易被高丰度蛋白掩盖。如血清白蛋白占血清总蛋白的50%以上，高丰度蛋白质与低丰度蛋白质的浓度比高达1000 倍以上。因此，常采用离心超滤、亲和层析等方法去除高丰度蛋白质，或采用离子交换、金属螯合树脂、疏水相互作用色谱柱等对目的蛋白进行富集和浓缩。Yang 等［21］利用iTRAQ 标记技术，依次采用基于“Top -Down”的凝胶电泳-质谱鉴定技术和基于“Bottom-up”的二维液相色谱-质谱鉴定技术分析了口腔鳞状细胞癌患者和健康人的血清蛋白质组，发现第一种方法可以定量281 个蛋白质，第二种方法可以定量319 个蛋白质，而且两种方法所定量的结果之间具有很大的重叠，说明蛋白质组学策略是发现血清中肿瘤生物标记物可靠而有力的工具。

2.2 组 织

肿瘤组织也是肿瘤标记物筛选的常用生物样本之一，其所含蛋白质直接与肿瘤发生发展相关，且蛋白含量高于血液、个体差异较小，但存在取材困难、易混有其他组织等困扰。手术取得的标本应尽量减少其在室温的时间，最好在30 min 内放入液氮冻存，以避免组织内蛋白质的降解。激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM)可直接在显微镜下从组织切片上精确地切割特定的细胞或细胞群，解决了组织中特定类细胞获取的问题，降低了背景干扰，极大地推进了肿瘤蛋白质组的研究。Zhu等［22］以CD24 为标记试剂，利用LCM 技术从40 nL胰腺癌组织及癌旁正常组织中分别提取了胰腺癌干细胞和非干细胞，并利用基于色谱的蛋白质组定量技术比较了胰腺癌干细胞和非干细胞的差异蛋白谱，发现375 个蛋白的表达差异2 倍以上。这些差异蛋白主要在肿瘤细胞迁移、侵袭、增殖等方面起重要作用，可能是潜在的肿瘤早期筛查的生物标记物或治疗的新靶点。

2.3 体 液

在生理或病理状态下，体液(如淋巴液、脑脊液、尿液、支气管液、胸腹水等体液)中的蛋白质会发生量或质的动态变化，如老年痴呆患者会在脑脊液中产生β-淀粉样蛋白。体液的成分相对简单、目的蛋白含量高、取材相对容易，可以说是一种较好的生物标记物研究材料。Davalieva 等［23］利用DIGE-质谱技术对前列腺癌和良性前列腺增生患者的尿液进行了差异蛋白质比较分析，发现23 个蛋白质的差异在1.8 倍以上，进一步丰富了用于前列腺癌早期筛查的生物标记物数据库。

2.4 细胞或动物等模式生物

模式生物包括各种肿瘤细胞系或动物模型，如线虫、果蝇、非洲爪蟾、蝾螈、小鼠等。模式生物由于具有易于在实验室内饲养和繁殖、实验操作简单、取材方便等优点而越来越受到广泛的关注。大连医科大学自主研制了在615 小鼠淋巴结转移率分别＞70%和＜30%的高转移细胞株(Hca -F)和低转移细胞株(Hca-P)模型。这两株细胞具有高度同源性但转移能力显著不同，是研究肿瘤淋巴道转移过程及机制的理想模型。Liu 和Sun 等［24-25］利用DIGE 和一维液相色谱质谱联用技术，对Hca -F 和Hca-P 细胞系进行了差异蛋白质组学研究，发现109 种差异表达的蛋白质，其中多种为首次报道与肝癌淋巴道转移直接相关［26-27］。

3 肿瘤分子机制的研究

蛋白质组学方法应用于肿瘤标记物的筛选，可以得到大量的差异蛋白信息，这些差异蛋白可能是与肿瘤发生发展密切相关的潜在标志物。进一步利用蛋白免疫印迹或免疫组织化学等方法对这些潜在标记物进行生物学验证，即可明确其应用于临床肿瘤诊断和预后判断的特异性和灵敏度，判断其临床意义。然而，如需进一步应用于临床的肿瘤治疗，则需进行肿瘤发生发展的分子机制研究，即需深入开展功能蛋白质组学的研究。

本实验室前期基于蛋白质组学技术筛选出差异蛋白——ALDOA［9］，随后在肺癌组织和细胞水平进行验证，发现其在肺鳞癌组织中表达上调，与质谱结果一致。并且发现ALDOA 在肺鳞癌组织中的表达水平与患者的生存时间密切相关，与肺鳞癌的转移、原发肿瘤大小状态和病理分期相关，与患者性别、年龄、肿瘤部位和分化程度无关，说明ALDOA 可能是肺癌的潜在标记物。此外，本实验室利用基因干扰技术体外抑制了人肺鳞癌细胞中ALDOA 的表达，发现ALDOA 基因在NCI-H520 细胞株中具有促进肿瘤增殖、迁移和侵袭能力的作用，ALDOA 可能通过参与细胞周期主要控制点G1/S 期和G2/M 期的调控，以及参与调控EMT 相关的分子机制等发挥作用。Xu 等［28］利用基于SILAC 的定量蛋白质学，研究了紫杉醇对HeLa 细胞的作用机制。他们发现紫杉醇作用前后，HeLa 细胞中347 个蛋白发生显著变化，这些差异蛋白参与众多生物学过程，如纺锤体组装、有丝分裂以及细胞粘附等。其中，细胞周期调控蛋白PDCD4 在紫杉醇刺激后的肿瘤细胞中显著下调，其可在多个肿瘤细胞系中调控对紫杉醇的敏感性，而且紫杉醇治疗后的肺癌患者组织中PDCD4的表达水平与患者的生存时间呈正相关。

Puig 等［29］发展了串联亲和纯化(tandem affinity purificaiton，TAP)技术，特别适用于在生理条件下研究蛋白的相互作用。该技术在不破坏目标靶蛋白结构的基础上，在靶蛋白一端插入一个蛋白质标签(TAP)，再经两步亲和纯化即可得到蛋白质复合体，随后利用质谱技术进行蛋白质鉴定。该技术因与传统技术相比具有周期短、假阳性少、无需预先知道复合体的组成或功能等优点而被广泛使用。

Selbach 等［30］进一步将免疫共沉淀、RNA 干扰(RNAi)、代谢标记(SILAC)、质谱定量等技术相结合，形成了QUICK 技术，进一步提高了鉴定到的相互作用蛋白质的特异性。Yang 等［31］利用免疫共沉淀结合稳定同位素标记-液质联用技术研究了细胞周期依赖激酶(CD9)复合物的生物功能。他们发现在RNA 激发前后分别有245 和162 个蛋白与CD9密切相互作用。RNA 激发前与CD9 相互作用蛋白主要具有RNA 解旋、核糖核酸外切、RNA 依赖的ATP 酶等功能;RNA 激发后与CD9 相互作用蛋白主要具有DNA 解旋、核糖体绑定、转录延长、未折叠蛋白绑定等生物学功能，证明CDK9 是一种动态的多功能酶复合物，不仅可调控转录延伸，而且还具有RNA 剪切和转录调控等功能。

4 展 望

生命科学已经进入了后基因时代，随着蛋白质组技术，尤其是定量蛋白质组的通量、准确性和灵敏度的不断提高，基因组、蛋白质组的数据以及相关生物信息学将会得到不断完善和丰富，可以预见基于蛋白质组学的肿瘤标记物筛选会得到更多的潜在肿瘤标志物信息，基于蛋白质学的肿瘤机制研究也会更加深入。但如何从浩瀚的数据中筛选出具有高特异性，并且可真正用于临床检测和治疗的肿瘤标记物，则仍需蛋白质组学、基础肿瘤学、临床肿瘤学等领域的研究人员的密切合作。

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