常用分子生物学技术在食品病原微生物检测中的应用

刘晓鹏尚丹

作者单位: 050000石家庄市，北京铁路局石家庄卫生防疫站

常用分子生物学技术在食品病原微生物检测中的应用

刘晓鹏尚丹

作者单位: 050000石家庄市，北京铁路局石家庄卫生防疫站

【关键词】聚合酶链式反应;实时定量PCR;环介导等温扩增法;基因芯片;酶联免疫吸附

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食品微生物检测对于保障食品安全起着及其重要的作用。传统的微生物检测方法虽然有效，但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题，难以满足现代社会快速检测的要求。随着细菌基因组学和分子生物学技术的飞速发展，诞生了许多分子生物学技术，它们因准确度和灵敏度高、特异性强、操作简便、检测周期短、效率高等优点，越来越被广泛应用。本文对在食品病原微生物检测中常用的几种分子生物学技术原理及应用作一综述。

1　聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)

1.1PCR原理美国人Mullis于1985年发明了PC技术，并荣获了1993年诺贝尔化学奖。PCR现在已成为生命科学领域最常用的分子生物学技术之一，它是一种体外酶促合成DNA片段方法，由变性、退火和延伸等几步反应组成一个循环，重复进行，最终使目的DNA以指数级迅速扩增。

常规PCR反应体系中包括模板、引物、Taq DN聚合酶、dNTP、Mg2+及缓冲液等成分。PCR反应的原理类似于DNA的天然复制，其一轮循环过程如下(1)变性，即在93～95℃高温下，是双链DNA解离形成单链; (2)退火，即在合适的温度下，引物与单链DNA模板的特异区域配对结合; (3)延伸，即在72℃下，Taq DNA聚合酶以引物的3’末端作为起始，以dNTP作为底物，按碱基互补配对原则，合成一条模板DNA链互补的新链。如此重复30个循环左右，目的基因就会被扩增一百万倍以上。

PCR技术中，引物的设计质量起到至关重要作用。在使用软件进行引物设计时，一般要遵循以下基本原则: (1)引物长度一般为18～30 nt; (2) GC含量为40%～60%，碱基尽可能随机分布; (3)避免引物本身或引物之间形成发夹结构或引物二聚体; (4)引物3’端的碱基要求严格配对，3’末端尽量不要以A结尾。

与传统的微生物检测方法相比，PCR具有特点: (1)灵敏度高:病毒检测的灵敏度可达3个RFU，细菌检测的最小检出率为3个细菌; (2)特异性强:对不同微生物型进行准确鉴定; (3)操作简便省时:一般1～2 h就可完成检测。

1.2常用PCR类型

1.2.1反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) :核糖体广泛分布于现存的所有生物，同种生物细胞中的rRNA序列保守性很强，可以利用rRNA碱基羞异进行菌株的分类鉴定。当需要对样本中微生物的rRNA作为模板进行PCR检测时，就需要用到RT-PCR。RT-PCR的基本过程:首先，提取检测样本中的总RNA;然后，采用随机引物、Oligo (dT)或特异性引物，以RNA作为模板，在反转录酶反转录成双链cDNA;最后，进行常规PCR。

1.2.2多重PCR(multiplex PCR) :多重PCR是在同一PCR反应管中同时加上多对病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。其主要优势:①经济高效，在同一反应管内同时检出多种病原微生物，大大的节省时间，节约经费;②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、无芽胞厌氧菌等同时进行检测。目前已在多种病原微生物的检测中进行了应用: Kim等［1］采用多重PCR技术成功对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌等进行了检测;蔡亦红等［2］建立的多重PCR体系，成功对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、福氏志贺菌等3种食源性致病菌实现了检测。

1.2.3实时定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qRT-PCR) : qRT-PCR是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，准确计算目的基因的初始丰度。qRT-PCR除了常规PCR技术的特点外，还具有以下主要优点:可以实时监测，结果直观;采用对数期分析，定量准确;无需凝胶电泳等后处理，减少对环境的污染。

最常用的qRT-PCR包括以下两种类型:①SYB Green荧光染料法，此方法除了加入常规PCR反应成分外，另外加入SYBR Green荧光染料。SYBR Gree荧光染料掺入DNA双链后，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR Green染料分子不会产生荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步②TaqMan探针法，此方法除了加入常规PCR反应成分外，需要加入一条两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团的探针。探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

陈苏红等［3］建立了检测SARS病毒的qRT-PC方法，最低可检测到5个拷贝的体外转录RNA分子特异性达100%。代娟等［4］针对编码大肠埃希菌耐热肠毒素I基因片段，采用MGB-TaqMan探针建立产耐热肠毒素大肠埃希菌qRT-PCR检测方法。徐德顺等［5］以金黄色葡萄球菌FemB基因作为靶基因，建立食品中金黄色葡萄球菌污染的快速敏感特异的qRT PCR检测方法。经实验证明，这些qRT-PCR检测方法不仅灵敏性高、特异性好、检测周期短、检测结果准确稳定，而且操作简便，适应食品微生物检验发展的需要，具有较大的推广及应用价值。

2　环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal ampli fication，LAMP)

LAMP是由Notomi等［6］开发出来的不同于PC的一种恒温核酸扩增方法，其原理是基于靶基因的个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bs DNA polymerase)的催化下，等温条件(65℃左右)保持几十分钟，即可完成核酸扩增，效率可达109～1010个数量级。在DNA合成时，从dNTP中释放的焦磷酸根与Mg2+发生反应，产生白色的焦磷酸镁沉淀。因此不需要繁琐的电泳和紫外检测，仅通过肉眼观察白色浑浊度，就能判断是否扩增。

Xu等［7］建立了快速检测葡萄球菌的LAMP方法Song等［8］建立了检测志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌的LAMP方法。Seki等［9］针对肺炎链球菌的lyt A基因序列，建立了LAMP检测方法。通过对10株肺炎链球菌和6株非肺炎链球菌的检测证明: LAMP法的特异性高，最低可检测到10个拷贝的DNA，灵敏度达到PCR法的1 000倍，用时仅为1 h。LAMP操作简单、快速、特异性强，不需要昂贵的仪器，不需要电泳及紫外观察等，在食品微生物检测中有着广泛的应用前景。

3　基因芯片

基因芯片，又称DNA微阵列(DNA microarray)，是20世纪90年代中期发展起来的一项分子生物学技术，是采用微加工技术将大量人工设计的基因片段有序的、紧密的排列固定于硅片等载体上构建而成的。通过与待测荧光标记样品进行杂交，用荧光检测系统对杂交后的芯片进行扫描，再通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而得出定性和定量的结果。基因芯片技术具有高通量、高自动化程度等特点，为全面、快速、准确地进行食品安全检测提供了一个崭新的平台。

基因芯片已被成功用于多种病原体的检测: Berger等［10］应用基因芯片技术对12株嗜酸乳杆菌进行了分析研究; Wang等［11］利用基因芯片技术为肺炎链球菌的监测提供了一个新的具有更高特异性和灵敏度快速分析方法;高兴等［12］探讨随机PCR结合基因芯片技术用于多种食源性致病菌筛查检测的可行性，成功对痢疾志贺菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、肉毒梭菌、肺炎链球菌、布氏杆菌、嗜肺军团菌等16种病原细菌进行检测筛查。但目前将基因芯片推广应用还面临诸多问题: (1)需要价格昂贵的仪器设备，芯片制备成本高，一般实验室难以承担其高昂的费用; (2)特异性有待提高，假阳性和假阴性仍影响结果的准确性; (3)尚未形成有效统一的制备、检测和数据处理标准，在很大程度上影响芯片结果的可重复性。相信随着芯片技术的不断发展和完善，检测操作方法的简便化，仪器的小型化和低廉化，有望在未来广泛应用于病原体检测。

4　酶联免疫吸附(ELISA)

Engvall和Perlmannn于1971年首次报道了有关酶联免疫吸附分析法用于IgG定量测定的技术。ELISA是以抗原和抗体的特异性结合反应为基础，与酶对底物的高效催化作用相结合的一种高灵敏度试验技术，根据酶作用于底物后的显色反应，借助比色或荧光反应来分析。比较常用的ELISA方法包括双抗体夹心法和间接法。ELISA检测的操作步骤包括:先将抗原或抗体包被到载体表面，加入待检标本与前者进行结合反应，然后再加入酶标记的抗原或抗体，最后加入酶反应的底物，生成有色产物，而产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色深浅进行定性或定量分析。ELISA建立在抗原抗体特异性结合的基础上，因此该方法特异性强，同时酶促反应具有将抗原抗体反应信号放大的作用，因此灵敏度较高。

ELISA已被广泛用于多种病原微生物的检测Holzhauser等［13］用间接竞争EL ISA法成功地检测出食品中含量低于2 mg/L的蛋白质。常娅莉等［14］针对于鼠疫菌rV抗原建立双抗体夹心ELISA检测方法对鼠疫菌检测以及流行病学调查奠定了基础。

食品安全是一个全球性重大公共卫生问题，建立更灵敏、更有效、更可靠、更简便的微生物检测技术是保证食品安全的迫切需求和食品微生物检测技术的发展趋势。分子生物学技术以其快速、准确、灵敏的优点逐渐成为微生物分类鉴定的主要手段，国外分子生物学技术在食品微生物检验中的应用研究已比较成熟国内由于各种条件的限制，目前实际应用并不多。

参考文献

1Kim JS，Lee GG，Park JS，et al.A novel multiplex PCR assay for rapi and simultaneous detection of five pathogenic bacteria: Escherichia co O157: H7，Salmonella，Staphylococcus aureus，Listeria monocytogenes and Vibrio parahaemolyticus.J Food Prot，2007，70: 1656-1662.

2蔡亦红，姚余有.3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立.中国卫生检验杂志，2007，17: 1959-1962.

3陈苏红，张敏丽，黄坚.SARS冠状病毒实时荧光RT-PCR定量检测生物化学与生物物理进展，2004，31: 249-254.

4代娟，李玉峰，袁粒星，等.MGB-TaqMan探针实时荧光定量在快速检测产肠毒素大肠杆菌中的价值.中华预防医学杂志，2008，42: 103 106.

5徐德顺，韩健康，吴晓芳.实时荧光定量-聚合酶链反应检测食品中黄色葡萄球菌方法的研究.疾病监测，2009，24: 541-544.

6Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal am plification of DNA.Nucleic Acids Res，2000，28: E63.

7Xu Z，Li L，Chu J，et al.Development and application of loop-mediatedi sothermal amplification assays on rapid detection of various types staphylococci strains.Food Res Int，2012，47: 166-173.

8Song T，Toma C，Nakasone N，et al.Sensitive and rapid detection of Shi gella and enteroinvasive Escherichia coli by a loop-mediated isotherm amplification method.FEMS Microbiol Lett，2005，43: 259-263.

9Seki M，Yamashita Y，Torigoe H，et al.Loop-mediated isothermal amplifi cation method targeting the lytA gene for detection of Streptococcus pneu moniae.J Clin Microbiol，2005，43: 1581-1586.

10Berger B，Pridmore RD，Barretto C，et al.Similarity and differences i the Lactobacillus acidophilus group identified by polyphasic analysis an comparative genomics.J Bacteriol，2007，189: 1311-1321.

11Wang Q，Wang M，Kong F，et al.Development of a DNA microarray toi dentify the Streptococcus pneumoniae serotypes contained in the 23 valent pneumococcal polysaccharide vaccine and closely related sero types.J Microbiol Methods，2007，68: 128-136.

12高兴，曲险峰，孙伟，等.多种食源性致病菌的基因芯片检测技术解放军医学杂志，2012，37: 765-769.

13Holzhauser T，Vieths S.Indirect competitive ELISA for determination traces of peanut (Arachis hypogaea L.) protein in complex food matri ces.J Agric Food Chem，1999，47: 603-611.

14常娅莉，焦磊，魏东，等.鼠疫耶尔森菌rV抗原单抗系统及其ELIS检测方法的建立.微生物学免疫学进展，2012，22: 13-18.

(收稿日期:2014－11－25

通讯作者:尚丹，050000石家庄市，北京铁路局石家庄卫生防疫站;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.041

【文章编号】1002－7386(2015) 09－1391－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 117