孕妇外周血游离胎儿DNA用于无创产前检测的研究进展

王庆琴　焦保权　苏铎　郝明吴小华

作者单位: 050081石家庄市，中国人民解放军白求恩国际和平医院妇产科

孕妇外周血游离胎儿DNA用于无创产前检测的研究进展

王庆琴焦保权苏铎郝明吴小华

作者单位: 050081石家庄市，中国人民解放军白求恩国际和平医院妇产科

【关键词】无创产前检测;外周血游离胎儿DNA;大规模平行测序

产前检查的主要目的对出生之前胎儿的染色体及基因的异常进行确诊，对家庭的优生优育以及预防控制新生儿发病都有十分重要的临床意义。传统的侵入性产前检查，包括:羊膜穿刺、绒毛取样(chorionic villous sampling，CVS)和脐带血穿刺，都可能对胎儿及孕妇产生一定的危害，并存在0.5%～1%流产的风险。利用微创或非创伤性的方法检测胎儿遗传性状的方法一直是科研及临所求追的目标，孕妇外周血游离胎儿DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)的发现则为无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)技术提供了一个全新的策略，并且在临床上得到广泛的应用。特别是近年来快速发展的大规模平行测序(massively parallel sequencing，MPS)技术，更加提高了检测的灵敏度和特异性，使得外周血cffDNA应用于胎儿性别、血型、单基因病、染色体相关疾病的检测方面，都得到了长足的发展。本文将对孕妇外周血cffDNA作简要介绍及近年来在临床的应用作一综述。

1　什么是cffDNA

1.1CffDNA的性质游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是可以自由循环于孕妇外周血，由小片段的细胞外DNA组成的遗传物质。cfDNA的主要来源于母体血细胞的破裂，而来自胎儿的DNA(cffDNA)平均只占10%。研究发现，通过cffDNA碎片可以整合胎儿全部基因组，其半衰期只有16 min，可以分娩2 h后迅速的消除，提示cffDNA具有一定的特异性，由此可见对cfDNA的分析在产前检测方面具有重要的意义。研究发现，当胎儿遗传物质比例(fetal fraction，ff)小于4%时，研究结果缺乏一定的可信性［1］。但ff随着孕周的增加而升高，研究表明，cffDNA最早可在孕龄4周时被检测到，怀孕约7周的孕妇外周血ff已达到检测的浓度要求［1］。但为了检测的准确性，检测时间一般选择孕中期以后。

1.2CffDNA的大小通过二代测序对cfDNA检测发现［2］，cfDNA片段大多在160 bp左右，只有极少数能达到340 bp，而Y染色体相关序列则一般小于150 bp由此提示cffDNA多数都小于母源性的cfDNA。正因如此，在设计NIPT实验时，需要将目的片段长度加以考虑，例如检测单基因突变型疾病时，设置较小的扩增子(小于150 bp)则足以完成对目的突变检测。但是某些疾病，并不是因为单基因的突变或者短序列的变化所导致，而是因为相邻三个核苷酸的重复导致基因功能的丧失，例如脆性X综合征(fragile X syndrome) 因(CGG) n的重复导致其功能基因FMR1长度可以达到1 kb。另外对亨廷顿舞蹈症(huntington disease HD)虽有成功诊断报道，但只有三联核苷酸(CAG) 在HTT基因外显子1区时，才成功被检测。Fan等［2研究发现，亨廷顿病(huntington disease，HD)患者的三联体重复都大于40，但由于cffDNA片段大小的原因只有重复数值在40～60才能被检测，而大于60时NIPT则显得有些乏力。

2　CffDNA的来源

2.1体内试验证明cffDNA来源于胎盘许多年来对cffDNA的来源，科学家们一直持有不同的意见，而目前被大多数接受的观点是，cffDNA主要来自于胎盘上一些特定细胞的核小体。研究表明，这些核小体是来自胎盘滋养层细胞凋亡所裂解的物质，并且孕期cffDNA的浓度一定程度上代表了滋养层的健康状态从细胞层面来说，胎盘是一个动态器官，在滋养层细胞的增殖分化过程中，发生着持续动态的细胞更替，并将凋亡的细胞物质排到母体，但此过程并不会引起炎症反应。Bischoff等［3］将从母体血浆中分离出的凋亡物质进行分类，并通过电子显微镜发现这些凋亡物质中存在核小体和染色质。有研究［3］发现，通过氧应激试验，将足月的胎盘组织培养在不同的氧分压浓度下(正常组10%和缺氧组0.5%)，20 h培养以后发现游离β-球蛋白DNA(cell-free β-globin DNA)的浓度在缺氧组中有了显著的提高。Gupta等［4］的一项研究同样证明了cffDNA的胚胎来源，他们直接从胎盘组织中分离得到合体滋养层微粒子(syncytiotrophoblast microparticles，SMs)，而SMs是合体滋养层融合过程中释放的产物，并且在SMs和培养上清中都能检测到胎儿的DNA。而临床中也发现，在母体血浆和血清中，cffDNA不管是作为游离分子还是存在于微粒的载体中，都成功被检测到。

2.2cffDNA来源于胎盘除了假性妊娠或胎盘血液循环未建立之外，只有当胚胎存在时才能检测到cffDNA。当存在病理性妊娠时，由于炎性反应会加速胎盘细胞的凋亡，进而导致母体血浆中cffDNA的浓度相对升高。在正常妊娠时，cffDNA会在分娩后迅速的消除，治疗性流产手术后，如果胎盘分离不完全，母体血浆中也同样会检测到cffDNA的存在。有些妊娠期胎盘组织存在不完全胚胎嵌合性(confined placental mosaicism，CPM)，使得胎盘组织与胎儿有着不同的基因型。Faas等［5］研究的1例妊娠中发现，通过cffDNA分析提示胎儿核型为45X，对滋养层细胞分析的核型同样为45X，但间充质核心组织的核型却是46XX，该现象充分证明了cffDNA的胎盘来源。有研究［5］报道，与对照组相比，进行CVS手术孕妇血浆的cffDNA浓度并没有显著性变化，而对双胞胎输血(twin-to-twin transfusion)症状的胎儿进行激光消融手术后，cffDNA的浓度会有明显的升高，该结果也同样印证了cffDNA来源于胎盘的事实。

2.3CffDNA主要来源于凋亡细胞而非胎盘本体

2005年，Wataganara等［6］研究母体cffDNA的浓度是否受到胎盘体积的影响，并将测量怀有男胎母体血浆中Y染色体特异基因确定cffDNA浓度并与模型比较发现，胎盘体积不会引起cffDNA浓度的变化，研究同样提示说明了胎儿DNA的释放是一种受到控制的过程，且此过程与胎盘大小无关。进而可以推测细胞凋亡似乎是胎儿DNA从胎盘进入母体的主要控制因素。研究发现，合体滋养层的炎性反应和胎盘的氧化作用也同样加速了细胞凋亡，进而导致cffDNA的释放。Hahn等［7］认为胎儿DNA的释放，为细胞凋亡和坏疽共同所致，实验证明细胞凋亡的细胞信号转导通路会进而引起合体滋养层组织的坏疽，而此过程直接导致cffDNA最终释放到母体。综上所述，结合体内和体外实验可以充分的证明cffDNA来源于胎盘组织，并且cffDNA母体外周血浓度对胎盘的健康状况有着良好的指导意义。

3　CffDNA的临床应用

3.1胎儿性别鉴定NIPT首次应用于临床是进行胎儿性别检测，传统检测方法(如绒毛膜取样、羊水穿刺、超声)可以准确检测胎儿性别要求孕龄至少在1周以后，而利用外周血胎儿DNA进行检测可以减少到7周［8］，因此利用cffDNA进行胎儿性别对预防和控制性连锁疾病有重要的意义。对于X连锁隐形遗传病(如血友病、杜氏肌营养不良)，如果母亲为携带者，则男胎有50%的概率患有该疾病，而对于经由cffDN确定怀有女胎的孕妇，可以免去传统有创检查确定性别的风险，且更早的作出诊断［9］。对于先天性肾上腺皮质增生(congenital adrenal hyperplasia，CAH)高风险妊娠的孕妇，产前的地塞米松治疗可以有效减轻女胎的生理畸形，而对于怀有男胎的孕妇，则无需过多治疗，因此通过cffDNA早期进行性别检测可以有效的消除孕妇的过度治疗。

最初NIPT技术检测胎儿性别是通过是否发现染色体特异性基因DSY14和SRY，但此方法只有在怀有男胎时才能被检测，而并非所有的孕妇的cffDNA浓度都能达到检测阈值，且其灵敏度只有80% 90%［9］。近年来随着QPCR和MPS技术应用，孕前期性别检测的准确度提升到97%～100%［10］。尽管在美国作为父母有权了解胎儿特征信息，并提供非医疗目的的性别选择，但国内由于传统观念及社会伦理因素胎儿的性别信息仍需要进行严格的控制。

3.2胎儿血型测定当RhD阴性母亲怀有RhD阳性血的胎儿时，孕妇外周血会有一定风险产生RhD抗体并在母体内长期保留，进而导致者胎儿或新生儿的溶血相关性疾病(haemolytic disease of the fetus and new born，HDFN)。因为RhD阴性的母亲不含有RhD基因，通过检测外周血中是否存在RhD基因，从而判断胎儿是否为RhD阳性。许多国家将此项技术都作为患有高危险HDFN孕妇的常规检测，当胎儿基因型为RhD阴性时，进行标准的产前保健，而当RhD阳性时则需进行早期的检测以防止宫内溶血和早期流产的发生。NIPT检测RHD血型的常规应用表现出极高的准确性，并且对产前预防性抗-D抗体的使用有着重要的临床指导意义，并且越是早期的检测，则越有利于减少对孕妇身体和心理的伤害。研究表明，利用MPS技术可以准确的鉴别孕龄11周胎儿的RHD血型［10］Clausen等［11］最近的一篇综述提示，通过NIPT胎儿血型的基因分型，其灵敏度和特异性都能达到99%以上;近几年的大规模临床研究也同样证实了其准确性［12］。由于在无创和准确方面的优越性，此技术在临床上检测RhD血型已得到广泛应用。

3.3单基因病诊断类似胎儿性别鉴定和胎儿血型测定的原理，通过检测孕妇外周血的疾病相关基因序列来确定胎儿是否遗传来自父亲相关疾病的等位基因，或者是否发生额外的基因突变。通过检测和排除此类基因序列可帮助确定诊断和排除相关的单基因病，也可用来确定胎儿HLA分型。但是此项技术在临床的应用进展并不快，主要因为存在个体遗传病风险的家庭相对较少，并且对于此类疾病的诊断需要针对性的个体化实验。

目前单基因在新生儿中的发病率约为3‰，而其检测的金标准仍为介入性的有创诊断。应用于临床的NIPT单基因病方案的限制条件是母亲不能携带有致病基因，主要通过PCR技术对相应位点进行特异扩增，检测扩增片段的长度、荧光值或者通过直接测序的技术比对突变点和野生型序列的区别，进而检测单个碱基的替换、缺失和插入。常见单基因病如肌强直性营养不良、软骨发育不全、亨廷顿病、地中海贫血、先天性肾上腺增生、囊性纤维化病都能够成功被检测。Papasavva等［13］通过49个在β球蛋白基因上的高杂合单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，检测101例可能患有父源性β-地中海贫血的胎儿，结果提示此方法对该疾病诊断有良好的灵敏度和特异性。

随着技术的发展，数字PCR和MPS技术的产生使得通过外周血检测胎儿母源性的单基因病成为可能。此两项技术原理是通过检测等位基因的突变型和正常型在外周血中的比例，进而确定胎儿是否携带致病基因。如果胎儿携带致病基因，则相对突变剂量会增加。大量临床研究提示此类技术可准确的诊断染色体隐形遗传病［14］。Tsui等［15］通过检测12例孕龄11周孕妇的外周血样本，成功检测出血友病高风险胎儿的基因型，为X染色体隐性遗传病的非侵入性产前诊断提供了蓝本。Lo等［16］利用外周血中游离DNA进行全基因组测序，整合出完整的孕妇和胎儿的基因组序列，并构基因组遗传图谱，此方法为无创产前基因诊断提供了一个新的方案，具有重大意义。

3.4非整倍体染色体病由于配子在减数分裂期间染色体分配发生异常，导致同源染色体发生数目上的改变，进而配子结合产生非整倍体合子。研究发现，平均每300个新生儿中就会有1个存在染色体病，并且染色体病导致流产的比例可达到35%［17］。但患有染色体病的胎儿仍有一部分能够成功分娩，并带有严重的生理缺陷，如21三体综合征(21-trisomy syndrome， T21)。早期的研究发现在怀有T21胎儿的孕妇血浆cffDNA的比例较正常组高。而近年来由于胚胎特异性标志物和检测技术的不断完善，并结合技术之间的相互运用，非整倍体染色体病的诊断取得不断的发展Papageorgiou等［18］通胎儿特异性甲基化与QPCR技术相结合的方法，成功在40例样本中检测到14例21三体综合征患儿，灵敏度和特异性都达到100%。

大规模基因组测序技术不仅推动了单基因病诊断的进步，同样使得非整倍体的诊断取得快速的发展，原理是通过孕妇外周血cfDNA扩增测序，读取大量的数据进行分析整合以达到对母体和胎儿每条染色体足够的覆盖度，并将每条染色体的比例与正常组进行比较从而对非整倍体病进行诊断。近年来大规模临床样本研究验证了MPS技术在无创诊断染色体病的优势，包括对13、18、21号染色体三倍体(T13、T18、T21)的检查，有着极高的准确性，并成为最有可能替代传统有创检查的新兴检查方法［19，20］。作为最小的常染色体，2号染色体在MPS中往往得到的数据量相对较少，而定向测序(targeted sequencing)的技术则很好的解决了这个问题。通过限制DNA区域，定向测序可以大大提高目的区域的覆盖度，减少无效数据产生，大大提高检测效率。Sparks等［21］通过定向测序的方法，成功从29个样本中诊断出39例21-三倍和7例18-三体，灵敏度和特异性都为100%，而读取的数据量只有非定向测序的5%。近年来又产生了基于SNP的定向测序(SNP-based targeted sequencing，S-Ts)技术同样非常高效。研究发现，此方法的一个重要优势在于高效检测T13、T18、T21的同时，性染色体核型异常也可同时被检测(例如X0，XXY，XXX，XYY)［22］。虽然定向测序的数据量不能对所有染色体达到足够的覆盖度，但能够在低通量测序仪同样进行非整倍体诊断，使得此项技术在一些中等规模的临床检测中心更受到欢迎。由于双胞或多胎的母体外周血中cffDNA的浓度确定和区分等困难因素，使无创技术对双(多)胎的检测较少。Grmminger等［23］对16例双胞胎样本进行检测，1例整倍体和4例21三体都准确检测，而并未出现假阳性和假阴性结果。据文献报道只有Grmminger等［23［24］分别对2例三胞胎样本进行了检测，但新生儿表型全部正常。虽然NIPT对单胎的染色体的数目异常诊断技术较为成熟，由于多种不可控因素，使得NIPT对双(多)胎的检测的准确性仍需大量的临床样本进行佐证。

3.5染色体片段异常诊断对于不平衡易位，理论上NIPT的检测结果应该是部分的染色体三体和单体在一项回顾性分析中，对已经确定的6例胎儿不平衡的孕妇外周血游离DNA进行检测，Srinivasan等［25］通过深度测序的方法全部成功识别，其中2例样本传统核型分析不能说明易位来源，而测序的方法则很容易解决，可以说明NIPT技术相对于传统核型分析更有优越性。但进行更小的易位则需要更加大量的测序数据和更高的数据分析能力。例如S-Ts技术，则需要足够多且有效的SNP才能完成对目标区域的准确检测。

而对拷贝数的变化，如核苷酸重复和缺失，通过NIPT技术也有成功的报道，例如在1例12号染色体的4-Mb的缺失［26］和2例22号染色体的3-Mb的缺失［27］都准确的被检测。Srinivasan等［25］对11例孕妇血浆cffDNA样本进行检测，发现其中8例样本的染色体拷贝异常，并通过流产组织的核心分析得到验证。因此，NIPT检测核酸拷贝数变化的临床应用，仍需要技术检测手段的创新。

孕妇外周血cffDNA的发现为NIPT提供了一个全新的方向，临床上检测胎儿性别、血型，cffDNA都发挥了重要的作用。尽管cffDNA在检测单基因病和染色体病是有一定的局限性，但随着技术检测方法的进步，相信此项技术可能会逐步添补或取代现有的检测方法。当前NIPT的临床应用虽然有限，但NIPT有着无创、广泛、早期等传统检测所不具有的特点，并可大大减低孕妇的痛苦，使得NIPT在临床方面有良好的应用前景。

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(收稿日期:2014－11－25

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.042

【文章编号】1002－7386(2015) 09－1394－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 714.5