标本放置温度和时间对T淋巴细胞活化标志检测结果的影响

沈天行，宋建新

（1.云县人们医院检验科，云南 临沧 675800；2.云南省第一人民医院检验科，云南 昆明 650032）

标本放置温度和时间对T淋巴细胞活化标志检测结果的影响

沈天行1，宋建新2△

（1.云县人们医院检验科，云南 临沧 675800；2.云南省第一人民医院检验科，云南 昆明 650032）

目的探讨标本放置温度和时间对流式细胞术检测T淋巴细胞活化标志结果的影响。方法采集健康体检者血液，EDTA－K2－抗凝，室温及4℃保存，在不同时间进行CD3＋T淋巴细胞CD69、CD25、HLA－DR检测。结果EDTA－K2－抗凝血室温保存标本与新鲜标本相比，CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋细胞百分率在12h开始减低，CD3＋CD69＋到16h明显减低（P＜0.05），CD3＋CD25放置到20h时明显减低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋细胞表达逐渐增高，到20h时明显增高（P＜0.05）；4℃放置的标本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋到24h时明显减低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋细胞表达到24h变化差异无统计学意义（P＞0.05）。结论作为T淋巴细胞的活化标志，室温放置标本检测CD3＋CD69＋应在12h内完成，CD3＋CD25＋应在16h内检测，CD3＋HLA－DR＋可在20h内检测，最好放置4℃保存标本。

T淋巴细胞； 活化标志； 温度； 时间

CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DA＋T淋巴细胞是一类已活化的免疫细胞，在免疫应答中起着重要的作用［1］。目前应用流式细胞仪检测T淋巴细胞活化水平已广泛应用于许多疾病特别是自身免疫性疾病发病机制的研究及疗效观察［2－3］，其准确性直接影响临床诊断及疗效观察。目前对外周血本放置时间对T细胞亚群检测结果的影响已有报道［4］，而对其活化标志的影响研究鲜见报道。本文对这一影响因素进行分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年4月本院健康体检者10例的标本，其中男5例，女5例，平均年龄34岁。

1.2 仪器于试剂 Beckman Coulter公司FC500型流式细胞仪，荧光标准微球Flow－Check、CD45－FITC、CD3－PE－Cy5、CD69－PE、CD25－PE、HLA－DR－PE及同型对照均购自Immunotech公司。

1.3 方法 空腹采集健康体检者静脉血于EDTA－K2－抗凝管各2.0mL，充分混匀，室温（20±5）℃及4℃冰箱保存。分别于采血后0、2、4、8、12、16、20、24h按常规方法用CD45－FITC/CD3－PE－Cy5/CD69－PE或CD25－PE、HLA－DR－PE标记并设同型对照；用荧光标准微球Flow－Check校准流式细胞仪的光路和流路，用同型对照设定阳性域值后检测，每份样本均检测并分析10 000个细胞，记录各抗原表达的百分率。

1.4 统计学处理 使用SPSS12.0统计软件包进行统计学分析，各抗原表达的百分率以表示，组间比较常用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

EDTA－K2－抗凝室温保存不同时间CD69、CD25、HLA－DR表达见表1。与0h相比，CD3＋CD69＋细胞表达百分率在12h开始减低，到16h明显减低（t＝2.57，P＜0.05），CD3＋CD25＋到20h明显减低（t＝3.18，P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋细胞表达逐渐增高，到20h时明显增高（t＝2.87，P＜0.05）。4℃保存不同时间CD69、CD25、HLA－DR表达见表2。与0h相比，4℃放置的标本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋表达到24h时明显减低（t＝3.47，t＝3.25，P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋细胞表达到24h的变化无统计学意义（t＝0.27，P＞0.05）。

表1 室温保存不同时间CD69、CD25、HLA－DR表达（，%）

＊P＜0.05，与0h比较。

保存时间 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DR＋0h 0.74±0.27 3.42±0.53 4.82±0.95 2h 0.75±0.26 3.39±0.58 4.88±0.94 4h 0.79±0.25 3.46±0.52 4.86±0.94 8h 0.79±0.24 3.47±0.54 4.87±0.95 12h 0.63±0.21 3.32±0.52 4.94±0.94 16h 0.47±0.17＊3.05±0.53 5.31±0.98 20h 0.31±0.16 2.68±0.51＊6.04±0.94＊24h 0.21±0.05 2.04±0.39 5.23±0.51

表2 4℃保存不同时间CD69、CD25、HLA－DR表达（，%）

保存时间 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DA＋0h 0.74±0.27 3.42±0.53 4.82±0.95 2h 0.76±0.27 3.41±0.55 4.83±0.96 4h 0.77±0.26 3.43±0.56 4.85±0.93 8h 0.79±0.26 3.45±0.55 4.84±0.94 12h 0.73±0.25 3.45±0.56 4.89±0.97 16h 0.69±0.26 3.40±0.57 4.88±0.96

续表2 4℃保存不同时间CD69、CD25、HLA－DR表达（，%）

＊：P＜0.05，与0h比较。

保存时间 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DA＋20h 0.62±0.21 3.21±0.48 4.91±0.93 24h 0.48±0.17＊2.92±0.31＊4.95±0.98

3 讨 论

CD69被称为活化诱导分子（AIM），早期活化抗原－1（EA－1）等，是C－型凝集素受体家族的成员。CD69是T淋巴细胞活化后最早表达的表面抗原，当其表达后，可作为共刺激信号促进T细胞进一步活化和增殖［5］。

CD25是IL－2R的α链，又称IL－2Rα分子或Tac抗原，为细胞因子受体。它是T淋巴细胞表面表达相对较早的标记，是活化细胞具有的抗原，在与β、γ亚基结合后形成具有高亲和力的IL－2R，IL－2R与IL－2结合后T细胞进入S期，完成克隆增殖。

HLA－DR是MHC－1Ⅰ类分子，具有高度多肽性，在调控抗原递呈细胞激活T细胞活化程度和特异性中起重要作用，是T细胞活化晚期表达抗原［1］。

CD3是T淋巴细胞的特异性表面标记分子，分析CD3＋T淋巴细胞中CD69、CD25、HLA－DA表达率目前已广泛应用于许多疾病特别是自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Graves病）发病机制的研究、疾病的活动情况及疗效的观察等［6－8］。目前检测CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DR＋常用流式细胞仪进行检测，对标本处理要求严格，因此本文探讨标本放置温度和时间对检测结果是否会有影响。

本组测定结果显示，EDTA－K2－抗凝的外周血在室温放置的情况下，CD3＋CD69＋细胞表达百分率在12h开始减低，到16h时明显减低（P＜0.05）；CD3＋CD25＋到20h时明显减低（P＜0.05）；CD3＋HLA－DR＋细胞表达逐渐增高，到20h时明显增高（P＜0.05）。故建议，室温放置的标本，对于CD3＋CD69＋的检测应在12h内检测，CD3＋CD25＋及CD3＋HLADR＋应在16h内检测。

4℃保存放置的标本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋表达到24h时明显减低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋细胞表达到24h变化无统计学意义（P＞0.05）。故建议，4℃保存放置的标本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋应在20h内检测，CD3＋HLA－DR＋可在24h内检测。

综上所述，为了减少EDTA－K2－抗凝标本放置温度和时间对CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DR＋测定的影响，标本最好放置4℃保存，并在相应的时间内测定，以消除由此引起的实验前误差，为临床提供更准确可靠的实验数据。

［1］Rea IM，McNerlan SE，Alexander HD.CD69，CD25，and HLADR activation antigen expression on CD3＋lymphocytes and relationship to serum TNF－alpha，IFN－gamma，and sIL－2Rlevels in aging［J］.Exp Gerontol，1999，34（1）：79－93.

［2］ 赵永强，董中升，刘占举.类风湿关节炎外周血和关节滑液中T细胞CD25CD69表达及意义［J］.医药论坛杂志，2007，28（3）：9－10.

［3］ 郭义龙，蔡翁义，蔡小丹，等.复发性生殖器疱疹患者外周血T细胞CD69和HLA－DR的表达［J］.中国麻风皮肤病杂志，2007，8（8）：667－669.

［4］ 汪鎏漪，宋建新.不同抗凝剂及标本放置时间对T淋巴细胞亚群检测结果的影响［J］.医学信息，2014，28（3）：138.

［5］汪慧英，James JL，Nancy AL.CD69的表达在小鼠嗜酸细胞的活化与凋亡中的作用［J］.中国病理生理杂志，2009，26（1）：1－6.

［6］章毅英，黄先玫，康曼丽，等.CD69和CD25及HLA－DR在川崎病患儿外周血T淋巴细胞中表达的研究［J］.中华儿科杂志，2006，44（5）：329－332.

［7］马晶波，李锋，冯树芳，等.系统性红斑狼疮患者外周血CD4＋CD8＋和CD22＋淋巴细胞活化分子CD69的表达［J］.中华风湿病学杂志，2003，7（2）：71－74.

［8］ 赵永强，董中升，刘占举，等.类风湿关节炎外周血和关节滑液中T细胞CD25CD69表达及意义［J］.医药论坛杂志，2007，28（3）：9－10.

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.063

B

1673－4130（2015）03－0420－02

2014－10－26）

△通讯作者，E－mail：songjianxin8＠126.com。