乙型肝炎病毒耐药基因变异位点与基因型及病毒载量的关系

戚应杰，岳 莉，朱义媛，刘 杨，石玉如

（安徽省合肥市传染病医院检验科，合肥 230022）

·临床研究·

乙型肝炎病毒耐药基因变异位点与基因型及病毒载量的关系

戚应杰，岳 莉，朱义媛，刘 杨，石玉如

（安徽省合肥市传染病医院检验科，合肥 230022）

目的研究81例慢乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因位点变异状况及其基因型分布特征，并探讨其与HBV－DNA、乙型肝炎E抗原（HBeAg）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的关系。方法采用荧光定量PCR和基因芯片反向斑点杂交技术检测81例慢乙型肝炎患者血清HBV－DNA载量、基因型和6种常见耐药位点；用电化学发光法检测HBeAg的含量，用酶法检测患者血清中ALT、AST的浓度。结果81例慢乙型肝炎患者中，HBV基因型B型38例占46.9%；C型38例占46.9%；B、C混合型5例占6.2%；未发现其他基因型。检测出的43例耐药基因位点发生变异：B基因型26例突变率为60.5%，C基因型17例突变率为39.5%；其中rt204V变异率为9.3%；rt204I变异率为34.9%；rt180M＋rt204I/rt204V变异率为41.9%；rt181V变异率为9.3%；rt236T变异率为4.7%。在43例出现基因位点变异的患者中，发生rt204I变异的B基因型占60%，HBV－DNA（U/mL）的对数值为5.73±1.77；C基因型占40%，HBV－DNA（U/mL）的对数值为6.93±2.12；发生rt204V变异的B基因型占75%，HBV－DNA（U/mL）的对数值为6.85±2.06；C基因型占25%，HBV－DNA（U/mL）的对数值为4.17±1.15；发生rt180M＋rt204I/rt204V变异的B基因型占22.2%，HBV－DNA（U/mL）的对数值为5.89±1.95；C基因型占77.8%，HBV－DNA（U/mL）的对数值为5.58±1.56；发生rt181V变异的全部为C基因型。结论HBV发生变异的位点以rt204I位点变异和rt180M＋rt204I/rt204V混合位点变异为主；在HBV发生变异的不同位点中C基因型更易发生rt181V位点和rt180M＋rt204I/rt204V混合位点变异，B基因型可能更易发生rt204V位点和rt204I位点变异；在发生rt204V位点和rt236T位点的突变中，HBV－DNA的载量B基因型组明显高于C基因型组，在发生rt204I位点的突变中HBV－DNA的载量C基因型组则明显高于B基因型组，C基因型较B基因型更易发生耐药位点变异。

慢性乙型肝炎； 基因型； 耐药基因位点； DNA检测； 乙型肝炎E抗原

乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝DNA病毒，主要引起急、慢性肝炎，肝硬化和肝癌等。如果病情反复活动或持续进展，则需要及时给予抗病毒治疗［1］。HBV的逆转录酶缺乏校正阅读功能，HBV的变异率较其他DNA病毒高十倍以上，HBV耐药变异的产生无法完全避免，目前已有报道发现针对拉米夫定（Lamivudine，LAM）以及阿德福韦酯（adfovirdipivoxil，ADV）预存耐药变异的病例［2－3］。因此，加强耐药管理，优化治疗显得更为主动。本研究旨在通过分析81例慢乙型肝炎患者HBV耐药突变位点的临床特点、基因型分布及病毒学特征，为临床抗病毒治疗与监测提供参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年6至2013年6月在合肥市传染病医院门诊就诊和住院的慢性乙型肝炎（CHB）患者81例，其中男46例、女35例，年龄18～72岁，平均（36±11）岁。CHB的诊断参照《慢性乙型肝炎防治指南（2010版）》［1］中的标准，所有病例甲、丙、丁、戊型肝炎均阴性，并按是否发生基因耐药位点变异分为变异组和非变异组。

1.2 试剂与仪器 美国ABI7300型实时荧光定量分析仪；厦门安普利9800型全自动荧光定量基因扩增仪；日立H7180型全自动生化分析仪；罗氏电化学发光仪；深圳亚能分子杂交仪。HBV－DNA试剂使用厦门安普利公司生产；乙型肝炎E抗原（HbeAg）测定使用罗氏公司生产试剂；HBV基因分型与耐药位点变异检测使用深圳亚能公司生产试剂；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）浓度检测使用宁波美康酶法试剂盒。

1.3 方法 用一次性无菌真空采血管抽取受检者静脉血2 mL，1 500r/min离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管中。标本可立即用于处理，也可－20℃储存备用。荧光定量HBV－DNA的检测采用厦门安普利9800型全自动基因扩增仪，试剂由安普利公司提供，按说明书要求操作。HBV基因分型以及耐药突变基因位点检测，利用PCR结合DNA基因芯片反向斑点杂交技术，可同时在同一芯片上检测B、C、D 3种常见基因型以及6个常见突变位点（rt180M、rt207I、rt204I、rt181V、rt236T、rt204V）。HBeAg定量检测采用电化学发光法；血清ALT、AST浓度检测采用动态速率法在生化仪上直接检测结果。

1.4 统计学处理 HBV病毒载量对数值、ALT、AST等计量资料以表示，组间比较采用t检验，率及构成比等计数资料的比较采用χ2检验，所有数据均采用SPSS10.0软件进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乙型肝炎患者基因型分布及其与HBV－DNA载量、HBeAg水平和ALT、AST水平的关系 81例慢乙型肝炎患者中，B型38例占46.9%，C型38例占46.9%，B、C混合型5例占6.2%；未发现其他基因型。基因型为B型和C型两组HBV－DNA载量的对数值、HBeAg水平和ALT、AST水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两种基因型患者HBV－DNA载量、HBeAg、ALT、AST水平的比较（）

基因型 n HBV－DNA（lg U/mL）HBeAg（COL）ALT（U/L）AST（U/L）.5 C型 38 5.26±2.09 261.7±51.1 85.6±20.3 9.8±16.8 t 0.682 1.325 1.568 1.862 P＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 B型 38 5.34±2.15 215.8±40.2 119.7±32.5 108.3±26

2.2 HBV变异组与非变异组HBV－DNA载量、HBeAg、ALT、AST水平的比较 将81例CHB患者分为变异组和非变异组。81例CHB患者中HBV发生耐药位点变异的为43例，占53.1%。变异组HBV－DNA水平明显高于非变异组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；变异组的ALT和AST水平明显低于非变异组（P＜0.05）；变异组与非变异组的HbeAg水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 HBV变异组与非变异组病毒载量、HBeAg、ALT、AST水平的比较（）

组别 n HBV－DNA（lg U/mL）HBeAg（COL）ALT（U/L）AST（U/L）变异组 43 5.91±2.26 212.3±48.9 131.5±25.6 71.9±15.8非变异组38 4.40±2.01 273.3±61.2 338.6±76.3 203.7±44.7 t 2.436 1.863 2.982 4.361 P＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.01

2.3 HBV基因突变位点与基因型之间的关系 在43例发生耐药基因位点变异的患者中，C基因型的突变率为60.5%，B基因型突变率为39.5%，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在15例发生rt204I位点的突变中，B基因型突变率为60.0%，明显高于C基因型的40.0%，在4例发生rt204V位点的突变中，B基因型的突变率（75.0%）也明显高于C基因型的突变率（25.0%），二者比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；在18例发生rt180M＋rt204I/rt204V混合位点的突变中和发生rt181V位点的突变中，C基因型突变率明显高于B基因型的突变率，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 HBV基因突变位点与病毒载量的关系 在15例发生rt204I位点的突变中，B基因型组HBV－DNA载量（U/mL）对数值为5.73±1.77，C基因型组为6.93±2.12。在4例发生rt204V位点的突变中，B基因HBV－DNA载量（U/mL）对数值为6.85±2.06，C基因型组为4.17±1.15，二者比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；而在18例发生rt180M＋rt204I/rt204V混合位点的突变中，B基因型组和C基因型组的HBVDNA载量对数值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

目前，我国流行的HBV基因型主要以B基因型和C基因型为主，HBV基因型存在地理分布差异，北方以C基因型为主，南方以B基因型为主［4－5］。本研究中，B基因型38例占46.9%；C基因型38例占46.9%；B、C混合型5例占6.2%；未发现其他基因型，提示本地区HBV感染基因型主要为B型和C型。研究结果提示，B基因型患者血清HBV－DNA水平、HBeAg水平、ALT和AST的浓度与C基因型相比均无明显差异。许利军等［6］报道B基因型患者的HBV－DNA水平低于C基因型患者，说明在拉米夫定无良好应答的患者中，C基因型患者更容易出现病毒载量升高。本研究结果与之不符，原因可能系本研究病例数不足及病例选择有关。赵鸿等［4］对884例HBV感染者的调查结果表明，未经抗病毒治疗的B基因型患者与C基因患者之间的病毒载量无明显差别。本研究中表2的结果显示，变异组患者中HBV－DNA的载量值明显高于非变异组，可能与发生耐药基因位点突变的患者更易发生病毒反弹有关；变异组与非变异组中的HBeAg水平无显著性差异；而非变异组中的ALT和AST水平明显高于变异组，其原因可能是变异组的患者绝大多数为使用核苷酸类药物治疗的CHB患者，其肝组织中的炎症程度与ALT和AST的异常程度并不相关［13］。

HBV P区位点变异是HBV对核苷（酸）类似物抗病毒药物发生耐药的分子基础，也是病毒反弹的重要原因之一。本研究结果显示，在对81例慢乙型肝炎患者HBV耐药基因位点突变检测结果中发现，43例患者HBV发生了耐药基因位点的突变，在43发生基因位点突变的患者中有15例发生了rt204I位点突变占34.9%和有18例发生了rt180M＋rt204I/rt204V混合位点的突变占41.9%，其他位点的突变占23.2%，提示rt204I位点和rt180M＋rt204I/rt204V混合位点变异在患者中最为普遍，是主要发生变异的位点，与许利军等［6］报道一致。在发生rt204I位点和rt204V位点的变异中，B基因型患者的突变率明显高于C基因型，这一结果可以解释潘小平等［7］研究提出的在拉米夫定耐药突变后，B基因型以YVDD突变为主。在发生rt181V位点和rt180M＋rt204I/rt204V混合位点的突变中，C基因型患者的突变率则明显高于B基因型，提示B基因患者易发生rt204I位点和rt204V位点的变异，而C基因型的患者更易发生rt181V位点和rt180M＋rt204I/rt204V混合位点的变异，rt236T位点变异有待于扩大样本量进一步研究。吴菲等［8］研究结果显示：阿德福韦酯耐药株感染者HBV，C基因型易发生rtAl81V/T变异，B基因型多出现rtN236T变异，因此，初步认为阿德福韦酯耐药株感染者病毒基因型与多聚酶基因区基因突变存在有一定的相关性，C基因型比B基因型更易出现rtAl81V/T＋rtN236T双突变，故推测阿德福韦酯耐药株感染者rtAl81V/T＋rtN236T双突变可能是造成C型患者比B型存在更严重肝损害的原因之一。CHB的发病既与病毒因素有关，又与宿主免疫因素有关［9］。一些非常见位点变异（如S256C、L229V等）虽然未在体外表型测定证实，但是临床调查结果显示其与拉米夫定耐药相关，而这些位点的变异是否在B、C基因型之间存在差别需要进一步研究［10－11］。Yuen等［12］的研究结果则显示，B基因型的HBV能活化Th1细胞且抑制Th2细胞，而C基因型相反，提示B基因型的HBV更能诱发人体的免疫反应，这也可能是B基因型的患者较C基因型的患者更容易出现良好应答且病毒载量较低的原因之一。在本研究中C基因型的突变率为60.5%明显高于B基因型，提示C基因型可能更易发生耐药基因位点的突变。

本文对HBV不同基因突变位点与病毒载量的关系进行了初步研究，结果发现在发生rt204I位点的突变中，B基因型组HBV－DNA载量低于C基因型组；在发生rt204V位点和rt236T位点的突变中，B基因型组HBV－DNA载量则高于C基因型组；而在发生rt180M＋rt204I/rt204V混合位点的突变中，B基因型组和C基因型组的HBV－DNA载量无明显差别，关于HBV其他基因型的变异特点，还需要扩大样本，作进一步的研究证实。

总之，HBV耐药基因突变一方面可出现对药物的耐受性，另一方面其复制能力也受到影响，而HBV－DNA载量作为与感染者预后直接相关的因素，决定了病情的进展。如果耐药株较野生株复制能力下降，则相应病毒载量会维持在一个较低水平，反之耐药株复制能力增强则可能加速病情进展。本文对慢乙型肝炎患者HBV耐药突变位点的临床特点、基因型分布及病毒学特征进行了初步研究，旨在为临床抗病毒治疗与监测提供参考价值。

［1］ 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.胃肠病学，2011，16（6）：351－366.

［2］ 侯金林，孙剑，王程.乙型肝炎病毒耐药变异研究的回顾与展望［J］.继续医学教育，2007，21（8）：19－21.

［3］隗佳，王华，李淑莉，等.慢性乙型肝炎患者血清中病毒的YMDD自然变异［J］.中华肝脏病杂志，2010，18（11）：855－856.

［4］ 赵鸿，李俊，李兴丰，等.感染乙型肝炎病毒不同基因型和亚型患者的临床特点分析［J］.中华流行病学杂志，2007，28（1）：74－77.

［5］Zeng G，Wang Z，Wen S，et al.Geographic distribution，virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in China［J］.J Viral Hepat，2005，12（6）：609－617.

［6］ 许利军，潘晨，李勤光，等.拉米夫定治疗无良好应答患者乙型肝炎病毒P区突变与基因型的关系［J］.中华肝脏病杂志，2010，18（3）：180－183.

［7］ 潘小平，李兰娟，杜维波，等.对拉米夫定耐药患者乙型肝炎病毒基因型与病毒载量及其核苷酸序列分析［J］.中华传染病杂志，2007，25（5）：285－288.

［8］ 吴菲，吕铁锋，郭晓凤，等.阿德福韦酯耐药株感染者乙型肝炎病毒基因型和多聚酶区基因变异分析［J］.医学研究杂志，2013，42（1）：122－124.

［9］Kreutz C.Molecular，immunological and clinical properties of mutated hepatitis B viruses［J］.J Cell Mol Med，2002，6（1）：113－143.

［10］Ciancio A，Smedile A，Rizzetto M，et al.Identification of HBV DNA sequences that are predictive of response to lamivudine therapy［J］.Hepatology，2004，39（1）：64－73.

［11］邓俊，张东华，于德敏，等.核苷（酸）类耐药患者中乙型肝炎病毒逆转录酶区基因变异类型及其特点［J］.中华肝脏病杂志，2009，17（5）：342－345.

［12］Yuen MF，Wong D，Zheng BJ，et al.Difference in T helper responses during hepatitis flares in hepatitis B e antigen（HBeAg）－positive patients with genotypes B and C：implication for early HBeAg seroconversion［J］.J Viral Hepat，2007，14（4）：269－275.

［13］金福顺，吴晓鹭，刘家俊，等.慢性乙肝患者血清转氨酶变化与肝组织学炎症程度相关性的研究［J］.福建医药杂志，2005，27（6）：139－141.

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.045

A

1673－4130（2015）03－0392－03

2014－10－21）