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药物淋巴细胞刺激试验在药物性肝损伤诊断中的意义

2015-03-21孙双双傅青春杨峻程明亮王晓今倪鎏达施莉琴王琳夏凡陈成伟

肝脏 2015年3期
关键词:淋巴细胞阴性阳性

孙双双 傅青春 杨峻 程明亮 王晓今 倪鎏达 施莉琴 王琳 夏凡 陈成伟

随着人们对药物性肝损伤(DILI)的不断认识和新药的不断开发,DILI发生率明显上升,但DILI无特异性的诊断标志,药物激发试验存在一定风险和伦理学问题。药物淋巴细胞刺激试验是一种无创的体外诊断方法[1]。20世纪70年代,日本学者鉴于过敏特异质性肝损伤,建立了药物淋巴细胞刺激试验(DLST)并沿用至今。2004年的DDW-Japan会议上,日本肝病学会针对DILI诊断提出了新方案,在1993年Danan方案基础上增加了DLST。40多年来DILI的检测方法不断趋于成熟,但由于缺乏多地区、可重复性数据,尚未被美国食品与药品管理局(food and drugs administration,FDA)批准,陈高艳等[2]于2010年也建立了DLST方法并作了初步报道。本研究对诊断为DILI行DLST的患者进行分析,以进一步评价DLST在DILI诊断中的意义。

资料和方法

一、研究对象

收取2011年7月至2014年8月确诊为DILI 84例,疑诊DILI患者17例,非DILI患者17例(基础肝脏疾病14例,肺结核2例,甲状腺功能亢进1例),72例健康人作为对照。检测对象平均年龄51岁(15~89岁),男51例,女67例。DILI临床诊断依据为排除其他病因引起的肝损伤,经RUCAM评分并结合专家意见作出,部分患者取得肝组织证据。

二、方法

(一)提取PBMC细胞 新鲜全血5 mL,超净台中取5 mL淋巴细胞分离液Ficoll于15 mL无菌离心管内,将3 mL抗凝血小心沿管壁缓缓加入其中,3 000 r/min,离心30 min,吸取PBMC层,将吸取的PBMC打入另一15 mL无菌离心管中,加入1×PBS 10 mL洗涤细胞,2000 r/min,10 min,弃上清液,用10%FCS-RPMI-1640细胞培养液调整细胞浓度为1×106个/mL[3]。

(二)细胞点板布局 取96孔细胞培养板设计点板布局。实验设健康对照组、阳性对照组和DILI组(可疑药物按循环血量一次给药量的血药浓度计算),每组均设3复孔。健康对照组:100μL细胞悬液+100μL细胞培养液;阳性对照组:100μL细胞悬液+100μL PHA 稀释液(终浓度10μg/mL);DILI组:100μL细胞悬液+100μL配置的药物。将96孔板周边孔加满水,以防边孔效应,放入37°C、体积分数为0.05的CO2培养箱中继续培养。

(三)3H -TdR(thymidine)掺入 细胞培养52 h后每孔加入10μL3H-TDR继续培养至72 h,取出培养板,用多头细胞收集仪收集各孔细胞于“9999”型玻璃滤纸;烘干后滤纸放入含1.5 mL闪烁液的液闪瓶中,于SN-6930型液体闪烁计数器检测CPM值。

(四)结果判断 计算SI,SI=(实验组均值-机器本底)/(对照组均值-机器本底),结果大于1.8为阳性。

三、统计学方法

采用SPSS17.0软件包处理数据。计量资料以均数±标准差表示,采用t检验,组间比较采用单因素方差分析,计数资料采用χ2检验,各指标动态曲线变化采用重复测量。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、DLST的总体检测结果

101例临床诊断或疑诊为DILI中 ,DLST阳性36例(35.6%),其中男15例,女21例;DLST阴性65例(65%),其中男33例,女32例。72例健康对照组中仅1例阳性,女性,27岁,作为对照投入药物为中药马勃,其服药史不详。临床诊断或疑诊为DILI 101例患者中,DLST检测的敏感度为35.6%,特异度为98.6%。敏感度可能还取决于所测试的药物对淋巴细胞致敏的程度。DLST阳性组和阴性组相比,性别差异无统计学意义(P=0.667)。

二、DLST检测与临床分型

DLST阳性患者中肝细胞型16例(44.4%),混合型8例(22%),胆汁淤积型5例(13.8%),无法判断7例(19.4%)。DLST 阴性患者中肝细胞型30例(46.1%),混合型18例(27.6%),胆汁淤积型6例(9.2%),特 殊 型 1 例 (15.3),无 法 判 断 10 例(15.6%)。DLST在胆汁淤积型检出率偏低,但差异无统计学意义。

三、DLST与临床表现的关系

118例患者中临床表现伴发热16例,其中确诊及疑诊为DILI 15例(DLST阳性8例,DLST阴性7例),非DILI 1例;皮疹9例,其中确诊及疑诊为DILI 6例(DLST阳性3例,DLST阴性3例),非DILI 3例;关节酸痛8例,其中确诊及疑诊为DILI 6例(DLST阳性2例,DLST阴性4例),非DILI 2例;嗜酸粒细胞比例增高者20例,其中确诊及疑诊为DILI 18例(DLST阳性13例,DLST阴性3例),非DILI 4例;差异有统计学意义(P=0.014),可见DLST与临床表现具有一定关联性。

四、DLST与RUCAM评分关系

按RUCAM量表诊断DILI,>8分:非常可能;6~8分:很可能;3~5分:可能;1~2分:不象;≤0分:无关。DLST阳性RUCAM评分患者6分14例,7分12例,8分9例,9分1例,≤5分者DLST均为阴性。本组结果表明DLST阳性者集中在6~8分的很可能段。DLST与RUCAM评分结合,应可以提高DILI诊断的准确性。

五、DLST与抗结核药引起的DILI

因服用抗结核药诊断或疑诊为DILI 35例,其中DLST阳性16例(45.7%)异烟肼、利福平、利福喷丁、吡嗪酰胺、链霉素。DLST阳性与药物激发试验(drug provocation test,DPT)结果有6例是一致的(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺各2例)完全与DPT结果相反的有3例,考虑个体差异,患者再次用药产生适应性反应,故需扩大样本进一步验证。

讨 论

DLST作为DILI的体外无创的诊断方法,最早用于诊断药物诱导的肺损伤及药物性肝病。Morii等[4]用DLST来诊断雌二醇导致的肝损伤。文献报道DLST敏感度各不相同[4-6],本研究显示 DLST 敏感度为36%。有报道指出使用自身血清比AB血清敏感性要高[7],在本研究中,起初使用小牛血清,改用AB血清发现敏感度较前有所提高,尚需扩大样本进一步检测验证。

本研究表明,DLST与RUCAM评分有较好的相关性。通过体外试验,评估过敏特异质性DILI患者肝损伤与目标药物之间的关系,可解决临床可疑肝损药物撤除和重新服用抉择上的无所适从。在目前尚无特异性诊断方法之前,DLST仍不失为一种可以作为主要诊断依据的方法。

本实验尚有值得改进的地方,如最早有人提出药物溶解度可以影响DLST的结果,随着技术的不断改进,这一问题也趋解决[8-10]。DLST 的结果与 DLST检测的时间具有一定的关联性[8],若在DILI发生1~2周内检测DLST为阴性,间隔2~3个月后再次检测可能为阳性,其机制并不是很清楚,可能与T淋巴细胞增殖的时间有关[4、11]。因此,DLST对药物诱导的肝损伤尚有诊断的价值,但需进一步改良。

本试验成功建立了DLST。3H-TdR掺入法进行DLST检测的方法学较为稳定,可作为一种协助过敏特异质性DILI诊断的实验室检测方法。

1 Ikegame S,Wakamatsu K,Fujita M,Nakanishi Y,Kajiki A.A case of isoniazid-induced liver injury diagnosed by use of the DLST,and successful reintroduction of isoniazid for pleural tuberculosis.Journal of infection and chemotherapy:official journal of the Japan Society of Chemotherapy,2011,17:530-533.

2 陈高艳,陈成伟,等.药物淋巴细胞刺激试验建立(3H-TdR)及其药物性肝病诊断中的应用.中华肝脏病杂志,2012,3:190-192.

3 渡辺 真彰.薬物性肝障害におけるリンパ球刺激の診断的価値と診断 指針の評価.肝臓,2001,42:448-453.

4 Morii K,Nishisaka M,Nakamura S,Oda T,Aoyama Y,Yamamoto T,et al. A case of synthetic oestrogen-induced autoimmune hepatitis with microvesicular steatosis.Journal of clinical pharmacy and therapeutics,2014,39:573-6.

5 Suzuki Y,Miwa S,Shirai M,Ohba H,Murakami M,Fujita K,et al.Drug lymphocyte stimulation test in the diagnosis of adverse reactions to antituberculosis drugs.Chest,2008,134:1027-1032.

6 Matsuno O,Okubo T,Hiroshige S,et al.Drug-induced lymphocyte stimulation test is not useful for the diagnosis of druginduced pneumonia.Tohoku J Exp Med,2007,212:49-53.

7 Miwa S,Suzuki Y,Shirai M,et al.Drug lymphocyte stimulation test is not useful for side effects of anti-tuberculosis drugs despite its timing.INT J TUBERC LUNG DIS,2012,16:1265-1269.

8 Yano S,Kobayashi K,Kato K,Tatsukawa T,Shishido S.The usefulness of lymphocyte stimulation test(LST)in side effects of antituberculosis drugs.Kekkaku,2004,79:7-10.

9 Mikio SAITO,Motohiro YAGI,Katsuji UNO,et al.Comparative Study of the Usefulness of the Drug-Induced Lymphocyte Stimulation Test and the Leukocyte Migration Test in Drug Allergies.Biol.Pharm.Bull,2008,31:299-304.

10 Fontana RJ.Pathogenesis of Idiosyncratic Drug-Induced Liver Injury and Clinical Perspectives.YGAST,2014,146:914-928.e911.

11 Pichler WJ,Tilch J,The lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity Allergy,2004,59:809-820.

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