H BsA g抑制浆样树突细胞分泌IF Nα和IL-12

魏万清 江红 杨长青 臧国庆 李丹

H BsA g抑制浆样树突细胞分泌IF Nα和IL-12

魏万清 江红 杨长青 臧国庆 李丹

目的 体外研究H BsA g对浆样树突细胞（pD C）功能的影响。方法 磁珠分离健康人外周血pD C，CpG O D N刺激成熟，再给予H BsA g刺激，E LIS A法检测培养上清中IF Nα和IL-12水平，流式细胞术检测pD C的表面C D40、C D80、C D83和C D86抗原，激光共聚焦显微镜检测pD C内H BsA g的存在情况。结果 实验所需的pD C细胞纯度≥95%。CpG-O D N2216刺激后，pD C表面C D40、C D80、C D83和C D86抗原的表达水平分别为78.67±2.04、83.63±3.23、71.82±2.91、70.52±2.22，培养上清中IF Nα和IL-12水平显著高于对照组。上述效应在加入H BsA g后被显著抑制。激光共聚焦显微镜显示在pD C细胞核周围有H BsA g存在。结论 H BsA g抑制pD C的成熟和分泌功能。这种作用可能是通过pD C对H BsA g的内吞实现。

乙型肝炎病毒表面抗原；浆样树突细胞

H B V感染的控制、转归及病毒清除，主要取决于宿主的免疫状态。研究发现，机体对H B V的耐受状态并不是因为淋巴细胞功能缺陷，而是由于抗原提呈细胞功能缺陷，特别是树突状细胞（dendritic cell，D C）功能缺陷引起，而造成抗原递呈功能障碍的原因是外界刺激不能诱导D C成熟，H B V本身或者H B V编码的病毒蛋白都有可能影响抗原提呈细胞成熟［1-2］。

根据表型和功能的差别，外周血D C分为2个亚群，髓样D C（m D C）和浆样D C（pD C）两类。m D C主要发挥抗原提呈作用，并分泌IL-12，诱导T h0细胞分化为T h1细胞，后者产生T h1型细胞因子介导细胞免疫应答。pD C是体内产生IF Nα的最主要细胞。越来越多的证据表明，pD C的数量和功能状态与疾病的发生和预后密切相关。

H BsA g大量存在于慢性乙型肝炎患者的肝脏以及血液中，在一些患者体内可高达100μg/m L，含量远远超过了感染性病毒颗粒［3］，提示其可能在H B V拮抗宿主的免疫反应中发挥重要的作用。本研究拟体外证实H BsA g对pD C功能的影响。

材料和方法

一、pD C的分离、鉴定及培养

抽取健康人外周血400 m L，用淋巴细胞分离液得到PB M C。应用美天旎公司的pD C磁珠分选系统，进行细胞分选；将得到的细胞进行C D123-P E及B D C A-2-FIT C抗体（B D Bioscience）标记，应用流式细胞仪进行阳性细胞鉴定，证实分选得到的pD C阳性细胞纯度≥95%。将分选得到的pD C分为4组，即Cp G O D N2216+H BsA g组、Cp G O D N2216组、H BsA g组和PBS组。将各组细胞在体外培养48 h。所有实验重复3次，每组实验设3个复孔。

二、流式细胞术检测pD C的表面抗原

收集、洗涤并重悬4组培养细胞，用流式细胞仪检测C D40、C D80、C D83和C D86的表达情况。

三、pD C培养上清液中IF N α和IL-12的检测

收集4组细胞的培养上清液，应用E LIS A法，检测IF Nα（Invitrogen）和IL-12（R&D System）的表达。

四、pD C内吞H BsA g检测

收集4组细胞，加入0.05%TritonX-100，再加入H BsA g一抗及荧光标记的二抗及核染料D A PI，激光共聚焦显微镜下观察。

五、统计学分析

结 果

一、流式细胞仪检测pD C的分离纯度

只有得到高纯度的pD C细胞，才使得后续实验顺利进行。结果如图1所示，分选得到的pD C阳性细胞纯度≥95%。

二、H BsA g抑制pD C活性分子表达及细胞因子分泌

流式细胞仪检测，新鲜分离的pD C几乎不表达C D40、C D80、C D83和C D86等4种细胞表面抗原。Cp G-O D N2216组中的4种抗原表达百分比显著增加，与其他3组比较，差异有统计学意义；Cp GO D N2216+H BsA g组中的4种抗原表达百分比，显著低于C P G组。见表1。Cp G-O D N2216刺激pD C分泌细胞因子，这种刺激作用被H BsA g显著抑制。见图2。

三、pD C内吞H BsA g

如图3所示，pD C细胞核周围有绿色荧光标记的H BsA g，提示pD C内吞H BsA g。

讨 论

pD Cs是体内产生IF Nα的最主要细胞，其分泌的IF N α占PB M C分泌总量的95%以上［4-5］。一旦发生病毒感染，pD C在受感染部位大量积聚，发挥强大的抗病毒作用［6-8］。H B V感染时，亦能见到pD C在肝脏的积聚［9］。国内外诸多研究小组关注D C的生理功能在慢性乙型肝炎（C H B）状态下发生的改变。目前对C H B患者外周血中D C亚群的频数是否改变还存在争议，但一致认为D C亚群的功能在C H B状态下受损［10-12］。C H B患者外周血m D C频数与血清A L T水平、病毒载量呈负相关［13］；经L A M抗病毒治疗后，pD C数量回升［14］。

H B V感染如何导致D C功能受损机制并不甚清楚。一些病毒，如HIV［15］、H C V［16］等，能够通过自身结构蛋白抑制pD C的功能来发挥拮抗宿主免疫清除效应。研究发现，单核细胞源性的D C能摄取H B V抗原，但不支持H B V进入细胞核，提示H B V不能在D C内复制，H B V蛋白可能是干扰D C功能的因素［17］。m D C能够吞噬H BsA g，在m D C成熟过程中如果存在H BsA g或者完整病毒颗粒导致m D C表面共刺激分子的表达降低，不能有效地刺激T淋巴细胞的增殖和分泌细胞因子，这些结果表明H B V完整病毒颗粒或H BsA g具有免疫调节能力，可以直接导致慢性H B V感染的患者m D C功能失调［18］。这些研究结果提示，C H B患者D C的功能受损并不依赖于H B V复制，而可能与H B V的结构蛋白相关。进一步研究显示，尽管H BcA g的免疫原性最强，但在机体内主要是通过B细胞而非D C进行抗原提呈［19-20］；且D C不能摄取外源性H BcA g，在机体内是以H BcA g/抗-H Bc免疫复合体的形式被D C提呈［20］。研究还发现，尽管H BcA g、不同截断体H BcA g及H BeA g能够在体外刺激H E K293细胞上的T L R信号通路，但H Bc/ H BeA g蛋白不是人T L R的配体，不能激活人T L R信号通路［20］。

本研究显示，H BsA g存在条件下，pD C表面分子表达减弱，分泌IF N α和IL-12水平降低。IL-12能帮助C T L清除受感染的肝细胞，并且上调IF Nα水平。Cp G-O D N2216刺激pD C分泌IF N α和IL-12的效应能被H BsA g抑制，提示H BsA g干扰pD C免疫功能。这种作用可能是通过pD C对H BsA g的内吞实现。H BsA g抑制pD C功能的具体机制有待进一步研究。

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H BsAg inhibits secretion of interferon-α and interleukin-12 from plasmacytoid dendritic cells

W EI W an-qing，JIA N G H ong，Y A N G Chang-qing，Z A N G Guo-qing，LI D an. Department ofDigestion，Tongji H ospital of Shanghai，Shanghai200065，China

Objective To investigate the effect of H BsA g on function of plasmacytoid dendritic cells（pD C）in vitro.M ethods pD Cs，sorted by im m uno magnetic beads，were divided into four groups：control group（incubated with PBS），H BsA g group（stim ulated by H BsA g），CpG-O D N group（stim ulated by CpG-O D N2216）and CpG-O D N/H BsA g group（stim ulated by CpG-O D N2216 and H BsA g）.Cytokines in the cell supernatant were measured by enzy me-linked im m une sorbent assay.Surface markers were analyzed by flow cyto metry，and endocytosis of H BsA g into cytoplasma of pD Cs was imaged by confocal microscope.Results The purity of pD Cs was m ore than 95%.The freshly isolated pD Cs expressed very low levels of cell surface markers（C D40，C D80，C D83，C D86），w hich was upregulated by CpGO D N2216 but dow nregulated by H BsA g.Activated pD Cs stim ulated by CpG-O D N2216 secreted high levels ofinterferon alpha and interleukin 6，w hich could be inhibited by H BsA g.In im m unofluorescence pictures，Green H BsA g was localized in pD Cs cytoplasm and accu m ulated around cell nucleus.Conclusion H BsA g causes the defects of pD Cs im m une functions，w hich might be achieved through the endocytosis of H BsA g by pD Cs.

H epatitis B surface antigen；Plasmacytoid dendritic cells

2014-10-24）

（本文编辑：钱燕）

国家自然科学基金资助项目（81102279）

200001 上海市同济医院消化内科（魏万清，杨长青）；上海交通大学附属第六人民医院感染科（江红，臧国庆，李丹）