肝衰竭患者外周血单核细胞H L A-D R的表达
2015-03-21李庆彦刘晶晶李庆方
李庆彦 刘晶晶 李庆方
肝衰竭患者外周血单核细胞H L A-D R的表达
李庆彦 刘晶晶 李庆方
目的 探讨不同病因所致肝衰竭患者外周血单核细胞H L A-D R基因m R N A表达及其意义。方法 随机选取肝衰竭患者40例，其中嗜肝病毒感染10例、药物性肝损伤10例、酒精性肝损伤10例、自身免疫性肝病10例。10名健康对照为本院健康志愿者。应用R T-PC R法检测各组患者外周血单核细胞H L A-D R基因m R N A表达，并动态观察H L A-D R基因m R N A表达的变化，及其与病程发展及临床症状的关系。结果 R T-PC R结果显示，嗜肝病毒感染组、正常对照组、药物损伤组、酒精损伤组、自身免疫组H L A-D R基因m R N A表达分别为137.51±5.22、18.14±1.29、19.64±2.03、11.25±1.22、26.61±2.31，且呈逐渐降低趋势，组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。对不同病因组患者单核细胞H L A-D R m R N A表达进行动态观察发现，17例死亡患者H L A-D R m R N A表达持续下降直至患者死亡；另外23例患者，经治疗各组H L A-D R m R N A表达逐渐恢复至接近正常水平，临床症状同步改善。结论 外周血单核细胞H L A-D R m R N A表达与肝衰竭的严重程度密切相关。
肝衰竭；H L A-D R；实时荧光定量反转录聚合酶链反应
肝衰竭是指在多种致病因素作用下，肝细胞缺血、缺氧性坏死和凋亡，肝脏发生大块坏死或者亚大块坏死的综合征［1］。
在肝衰竭形成的过程中，单核/吞噬细胞系统发挥重要作用。单核/巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞，是机体防御病原性异物侵袭的第一道防线，也是联系固有免疫和特异性免疫应答的重要媒介。单核细胞可活化为巨噬细胞，通过吞噬、廓清抗原，清除异物，并可通过分泌细胞因子引起炎性反应或增强免疫应答。单核细胞还是专职抗原提呈细胞，通过M H C-II类分子与抗原肽结合表达于细胞表面供T淋巴细胞识别，启动特异性免疫应答。单核细胞M H CII类分子表达高低与抗原提成功能强弱呈正相关。
H L A-D R是重要的M H C-II类分子，单核细胞表面H L A-D R表达水平可反映机体免疫功能状态。H L A-D R可在单核细胞接受外来刺激活化后表达上升，但在严重疾病状态下，如脓毒血症、重症胰腺炎等，可出现显著下降，呈免疫麻痹状态。Lin等［2］报道Child C级肝硬化患者单核细胞H L A-D R表达低于健康对照组，采用脂多糖体外刺激H L A-D R低表达单核细胞，T N F-α分泌量显著下降。Berres等［3］通过对肝硬化患者单核细胞H L A-D R表达特点的随访发现，重症监护的肝硬化患者中，存活者单核细胞表达H L A-D R稳定或者升高，而H L A-D R表达持续下降者预后不良。Berry等［4］也证实失代偿期肝硬化单核细胞H L A-D R表达低于40%预后较差。
本研究观察不同病因所致肝衰竭患者外周血单核细胞H L A-D R m R N A的表达特点，并对其机制进行初步探讨。
资料和方法
一、研究对象
随机选取2010年至2014年山东聊城市人民医院肝衰竭患者40例，其中嗜肝病毒感染10例、药物性肝损伤10例、酒精性肝损伤10例、自身免疫性肝病10例；10名健康对照为本院健康志愿者。
二、荧光定量R T-P C R引物及探针
H L A-D R引物及探针由上海斯丹赛生物工程有限公司合成、标记。其中在探针5′端标记上荧光报道基团F A M（6-carboxy-fluores-cein），3′端标记上荧光淬灭基团TA M R A（6-carboxy-tetramethy-rhodamine）。
三、标本采集
入组患者分别于入院第1、4、8、12、16、20天采集静脉血3 m L，动态检测H L A-D R m R N A表达，并分析其与临床症状变化的关系。
R N A的提取与定量：分离培养单核细胞，洗脱收集细胞备用。用无R N A酶的双蒸水配制的PBS洗涤，应用T RIzol提取各组总R N A，方法按试剂说明书进行。所提取的总R N A用紫外分光光度计定量，A260 n m/A280 n m≥1.8，总R N A完整性经琼脂糖电泳，可见明显的28S、18S两条带。
四、cD N A合成
按反转录试剂盒说明书进行，20μL体系中含总R N A 1μg、4μLM gS O4（25m m ol/L），2×Bcalst Buffer 10μL，1.5μL R Nase Free H2O，10 m m ol/L d N T PMixture，1μLOliogo dT Primer，0.5 μL Rnase Inhibitor（40 U/μL），1μL BcaBest Poly merase （22 U/μL）65℃1 min，30℃5 min，65℃30 min，98℃5 min，5℃5 min，合成好的cD N A置-20℃保存待测。
五、实时荧光定量P C R
（一）构建载体 用T-A载体克隆法，将635 bp H L A-D R扩增产物克隆至pG E M-Teasy载体，用质粒D N A试剂盒提取质粒D N A，紫外分光光度计定量，稀释成不同的浓度梯度作为制备标准曲线的模板。
（二）P C R 在50μL体系中含1×Taq man缓冲液，3.5 m m ol/L M gCl2，200μm ol/L d A T P、dC T P和dG T P，400μm ol/L d U T P，1.25 U a m pilTaq Gold，0.5 UA m p Erase U N G，H L A-D R上下游引物各0.3μm ol/L，荧光探针20 n m ol/L，100 ng R N A反转录得到的cD N A或不同浓度的定量模板。
（三）P C R条件 50℃2 min，95℃10 min，然后95℃15 s，60℃30 s，共40个循环，每个样本均做3个平行管，P C R结束后，根据标准曲线仪器自动进行分析，算出待测样品的起始拷贝数。
六、统计学分析
结 果
一、各组单核细胞H L A-D R m R N A表达
单核细胞H L A-D R m R N A表达水平在嗜肝病毒感染组为137.51±5.22、药物性肝损伤组为（18.14± 1.29）、酒精性肝损伤组为（19.64±2.03）、自身免疫性肝病组为（11.25±1.22）、健康对照组为（26.61± 2.31）。
二、各组患者单核细胞H L A-D R m R N A表达的动态观察结果
17例病情逐步加重并死亡患者（其中嗜肝病毒感染组5例、药物损伤组3例、酒精损伤组2例、自身免疫组7例）随着病情的发展，虽然临床进行积极救治，但H L A-D R m R N A表达仍未改善并持续下降直至死亡；23例存活患者病情逐步好转，经治疗各组H L AD R m R N A表达逐渐恢复至接近正常水平，临床症状同步改善。各组死亡患者和存活患者H L A-D R m R N A动态水平见表1，表2。
表1 各组死亡患者单核细胞H L A-D R m R N A动态表达水平（±s）
表2 各组存活患者单核细胞H L A-D R m R N A动态表达水平（±s）
讨 论
H L A-D R是单核细胞重要的活化标志，也是单核细胞表达的功能性分子，因而单核细胞表面H L A-D R表达水平的高低可反映单核细胞的功能状态。有研究表明，内毒素血症引起单核细胞H L A-D R表达下调［5-7］。肝硬化患者单核免疫功能麻痹不仅与单核细胞H L A-D R表达下降有关，而且与单核细胞的功能相关；失代偿期肝硬化单核细胞H L A-D R表达低于40%预后较差［2-3］。V olk等［8］认为C D14阳性单核细胞H L A-D R水平是判断脓毒症免疫状态的重要指标，以表达水平＜30%作为阈值可筛选出处于免疫抑制状态的患者，对这些患者进行免疫刺激可有效逆转免疫抑制或改善预后。因此，H L A-D R的表达率是判断肝衰竭患者是否合并免疫抑制的重要指标，且与不良预后密切相关［9］。
嗜肝病毒感染损伤肝细胞的机制尚未完全清楚，既往认为过强的免疫反应是嗜肝病毒感染性肝衰竭发生的主要因素，以细胞毒性T淋巴细胞为主的细胞免疫是造成细胞凋亡和坏死的主要因素。本研究发现，入院时嗜肝病毒感染组H L A-D R m R N A表达显著高于其他病因组及正常对照组，可能与过强的免疫反应相关。药物性肝损伤及酒精性肝损伤组因长期的药物及酒精蓄积引起机体免疫系统功能紊乱，免疫抑制，本研究中药物性肝损伤组及酒精性肝损伤组H L A-D R m R N A表达显著低于健康对照组可能与此相关。自身免疫性肝病组因机体免疫系统对自身肝细胞抗原成分是耐受，产生自身抗体及自身反应性T细胞所致，可能因长期的免疫耐受，导致H L A-D R m R N A表达显著降低。
对不同病因患者H L A-D R m R N A表达进行动态观察发现，17例死亡者H L A-D R m R N A表达持续低下，而23例存活者，随症状改善H L A-D R m R N A表达呈逐渐上升趋势，直至恢复至接近正常水平。该结果提示，H L A-D R m R N A表达与不同病因肝功能衰竭的临床转归及预后密切相关。研究显示，当H L AD R m R N A表达显著降低时，患者可能存在严重的免疫抑制，临床应考虑采用免疫治疗措施［10-11］。本研究动态观察结果显示，将H L A-D R m R N A表达作为肝衰竭重症的判断阈值是可靠的，H L A-D R m R N A表达不仅是评价疾病严重程度的有效指标，也可作为肝衰竭的预后评估指标。
本研究提示，单核细胞H L A-D R m R N A表达能反映不同病因肝衰竭，尤其是重症患者机体免疫抑制状况，可作为预测预后及指导免疫刺激治疗的一项敏感而有效的指标；动态观察单核细胞H L A-D R表达率可监测疾病的发生发展及对预后作出正确评估。
1 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19：56-62.
2 Lin C Y，Tsai IF，H o Y P，et al.Endotoxemia contributes to the im m uneparalysis in patients with cirrhosis.J H epatol，2007，46：816-826.
3 Berres M L，Schnyder B，Yag m ur E，et al.Longitudinal m onocyte hu man leukocyte antigen-D R expression is a prognostic marker in critically ill patients with deco m pensated liver cirrhosis.Liver Int，2009，29：536-543.
4 Berry P A，Antoniades CG，Carey I，et al.Severity of the compensatory anti-infla m matory response determined by m onocyte H L A-D R expression may assist outco me prediction in cirrhosis.Intensive Care M ed，2011，37：453-460.
5 Raposo G，M oore M，Innes D，et al.Human macrophages accumulate HIV-1 particles in M H C Ⅱ co m partments.Traffic，2002，3：718-729.
6 Soares-Schanoski A，Jurado T，Córdoba R，et al.Im paired antigen presentation and potent phagocytic activity identifying tu m ortolerant hu man m onocytes.Biochem Biophys Res Co m m un，2012 ，423：331-337.
7 W olk K，K unz S，Cro m pton N E，et al.M ultiple mechanisms of reduced major histoco m patibility co m plex class II expression in endotoxin tolerance.J Biol Chem，2003，278：18030-18036.
8 V okl H D，Reink P，Krausch D，et al.M onocyte deactivation rationale for a new therapeutic stratery in sepsis.Intensive Care M ed，1996，22：474-481.
9 A beles R D，M cPhail M J，Sowter D，et al.C D14，C D16 and H L AD R reliably identifies hu man m onocytes and their subsets in the context of pathologically reduced H L A-D R expression by C D14（hi）/C D16（neg）m onocytes：Expansion of C D14（hi）/C D16（pos）and contraction of C D14（lo）/C D16（pos）m onocytes in acute liver failure.Cyto metry，2012，81：823-834.
10 林洪远，郭旭生，姚咏明，等.C D+14单核细胞人类白细胞抗原-D R预测脓毒症预后及指导免疫调理治疗的初步临床研究.中国危重病急救医学，2003，15：135-138.
11 苏磊，孟繁甦，唐柚青，等.创伤脓毒症患者免疫状态监测及乌司他丁联合胸腺肽α1行免疫调理的临床研究.解放军医学杂志，2008，11：1366-1368.
Expression of H L A-D R m R N A from peripheral blood mononuclear cells in patients with liver failure
LI Qing-yan，E m ail：sdliqingy73@163.com
Objective To investigate the H L A-D Rm R N A expression fro m peripheral blood m ononuclear cells （PB M Cs）of liver failure patients with different pathogenesis.M ethods Forty patients with liver failure fro m 2010 to 2014 in our hospital were enrolled and divided into 4 groups according to pathogenesis.M ean w hile，10 persons undergoing health examination were involved as control.Expression of H L A-D R m R N A fro m PB M Cs was detected by real time-poly merase chain reaction（R T-PC R）at day 1，4，8，12，16，20 after hospitalization，to analyze its relevance with liver failure progress and clinical sy m pto ms.Results There was significant difference in H L A-D R m R N A expressions am ong 4 groups.The level of H L A-D R m R N A decreased continuously without amelioration in 17 died patients，w hile thatincreased gradually to normallevel with sy m pto m im proved in other 23 survived patients.ConclusionExpression of H L A-D R m R N A fro m PB M Cs is closely related to severity of liver failure，w hich might be a valuable parameter to evaluate severity and prognosis of liver failure in clinic practice.
Liver failure；H L A-D R；R T-PC R
2014-10-24）
（本文编辑：钱燕）
252000 山东省聊城市人民医院感染病科
李庆彦，E mail：sdliqingy73@163.co m
LI Qing-yan，LIU Jing-jing，LI Qing-fang. Department of Infectious Disease Liaocheng People′s H ospital，Shandong252000，China
