流式细胞仪性能评价方法的建立

王小林，李 昂，杨 硕

（北京大学第三医院检验科，北京 100191）

流式细胞仪性能评价方法的建立

王小林，李 昂，杨 硕

（北京大学第三医院检验科，北京 100191）

目的建立流式细胞仪性能评价方法。方法基于《YY/T0588－2005流式细胞仪》行业标准，利用BriCyte E6流式细胞仪，建立适用于流式细胞仪性能评价的测试方案，包括荧光灵敏度、荧光线性、前向角散射光检测灵敏度、仪器分辨率、前向角散射光和侧向角散射光分辨率、倍体分析线性、携带污染率、表面标志物检测准确性、表面标志物检测重复性、仪器稳定性等。结果该流式细胞仪各项性能指标均满足行业标准规定的技术要求。结论上述性能指标测试方法可靠，能够对流式细胞仪性能进行全面评价。该方法对于流式细胞仪性能验证有一定的指导意义。

流式细胞仪； 性能评价； BriCyte E6

流式细胞仪主要用于细胞生物学、免疫学等科学研究领域，以及临床医学领域，特别是在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）和肿瘤患者淋巴细胞免疫功能评价、白血病免疫分型及微量残留病诊断方面，具有不可替代的作用［1－2］。本研究以《YY/T0588－2005流式细胞仪》为依据，建立了流式细胞仪性能评价方案，旨在为流式细胞仪整体性能评价提供详细、完整的测试方案。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 迈瑞公司BriCyte E6流式细胞仪及配套CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色试剂和溶血剂；Duke公司Duke Standards（3K1000）、Duke Standards（4K－03）标准微球；Spherotech公司Rainbow calibration particles （RCP－30－2）、Rainbow calibration particles（RCP－30－5A）标准微球；BD公司DNA QC Particles标准微球；R＆D公司Status－Flow®Flow Cytometry Control质控品。

1.2 方法

1.2.1 荧光灵敏度 取适量RCP－30－5A标准微球，用1 mL鞘液稀释混匀后上机检测，获取各个峰的平均荧光强度。根据标准微球说明书提供的各个峰的等量可溶性荧光分子数（MESF），按照随试剂附带的标准软件进行统计计算。技术要求:FITC不大于200 MESF，PE不大于100 MESF。

1.2.2 荧光线性 取适量RCP－30－5A标准微球，用1 m L鞘液稀释混匀后上机检测，得到各个峰的平均荧光强度。根据标准微球说明书提供的各个峰的MESF，以MESF（Y）和平均荧光强度（X）的线性回归方程，计算线性相关系数（r）。技术要求:r≥0.98。

1.2.3 前向角散射光（FSC）检测灵敏度 取1μm 3K1000标准微球，加入装有1 mL鞘液的试管中，充分混匀后上机检测，检查直方图上显示的峰值信号及显示峰值信号的标准微球直径。技术要求:FSC检测灵敏度应不大于1μm。

1.2.4 仪器分辨率 将RCP－30－2标准微球稀释于1 m L磷酸盐缓冲液（PBS）中，混匀后上机测试，获取FSC和FL1～6各荧光通道的变异系数（CV）。技术要求:FSC通道CV≤2.0%；FITC、PE通道CV≤2.0%；PerCP、PE－Cy7、APC、APCCy7通道CV≤4.0%。

1.2.5 FSC和侧向角散射光（SSC）分辨率 （1）取5μL枸櫞酸钠抗凝外周血，加入装有1 m L鞘液的试管中，混匀后上机检测。技术要求:FSC/SSC图应能将外周血中的血小板和红细胞分开。（2）取100μL乙二胺四乙酸抗凝外周血，溶血处理后上机检测。技术要求:FSC/SSC图应能将外周血的白细胞三群（淋巴细胞、单核细胞、粒细胞）分开。

1.2.6 倍体分析线性 DNA QC Particles中的小鸡红细胞核（CEN）或小牛胸腺细胞核（CTN）经过碘化丙啶（PI）染色后上机检测，获取G2/M期（四倍体细胞峰）与G0/G1期（二倍体细胞峰）平均荧光强度，计算二者比值。技术要求:比值范围1.95～2.05。

1.2.7 携带污染率 取适量4K－03标准微球，用1 m L鞘液稀释混匀后连续上机测试3次，计算标定区域的颗粒数，分别记为H1～1、H1～2、H1～3。进行一次标本管返冲循环后，再进行空白数量测试，连续测试3次，计算标定区域的颗粒数，分别为L1～1、L1～2、L1～3。按照此程序循环3次，再计算携带污染率值Ci），取最大值。

式中:Ci为第i次循环的携带污染率，i＝1～3。技术要求:携带污染率不大于1%。

1.2.8 表面标志物检测的准确性 使用CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色试剂对StatusFlow®Flow Cytometry Control质控品进行CD3、CD4、CD8标记，重复5次，测定CD3、CD4、CD8阳性百分比，分别计算平均值。技术要求:结果应在质控品说明书给定的参考范围内。

1.2.9 表面标志物检测的重复性 使用CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色试剂对StatusFlow®Flow Cytometry Control质控品进行CD3、CD4、CD8标记，重复测定20次，分别计算CD3、CD4和CD8阳性百分比结果的CV。技术要求:CV≤10%。

1.2.10 仪器稳定性 环境温度变化不超过设定温度的5%时，取适量RCP－30－2加入装有1 m L PBS的试管中，充分混匀后上机检测，得到标准微球平均荧光强度（FL1）。连续开机8 h后，在流式细胞仪的相同设置条件下重复前述步骤，得到标准微球的平均荧光强度（FL2）。按公式计算FL1、FL2偏差值（B）。

技术要求:在8 h内检测FSC及所有荧光通道峰值平均荧光强度偏差值不超过±10%。

2 结 果

2.1 荧光灵敏度和荧光线性 FITC通道荧光灵敏度为48 MESF，PE通道荧光灵敏度为50 MESF，二者的r分别为0.997 8、0.997 2，满足规定的技术要求。

2.2 FSC检测灵敏度 FSC检测灵敏度检测结果见图1，直方图上显示直径为1μm微球的信号峰，满足规定的技术要求。

2.3 分辨率 FSC及各荧光通道（FL1～6）的CV分别为1.2%、1.0%、1.5%、2.0%、2.6%、3.2%、2.4%，均满足规定的技术要求。

2.4 FSC和SSC分辨率 FSC和SSC散点图可将淋巴细胞、单核细胞、粒细胞分开，也能将血小板和红细胞分开，满足规定的技术要求，见图2。

2.5 倍体分析线性 G2/M期和G0/G1期平均荧光强度分别为527 383.1、266 246.7，比值为1.98，满足规定的技术要求。

2.6 携带污染率 3次检测的携带污染率分别为0.02%、0.04%、0.03%，满足规定的技术要求。

2.7 表面标志物检测准确性 质控品CD3、CD4、CD8阳性百分比的平均值均在说明书给定的参考范围内，满足规定的技术要求，见表1。

2.8 表面标志物检测的重复性 质控品CD3、CD4、CD8阳性百分比结果的CV分别为0.83%、1.31%、2.40%，满足规定的技术要求。

2.9 仪器稳定性 0 h和8 h检测了FSC及FL1～6荧光通道平均荧光强度，偏差值均满足规定的技术要求，见表2。

3 讨 论

关于流式细胞仪性能的评价，国际上还没有公认的方法和要求。对于科研领域而言，一般通过考察重复性和荧光灵敏度等指标，即可对仪器性能做出初步评价［1，3－5］，但对于医学领域来说，仅仅考察重复性和荧光灵敏度是不够的。流式细胞仪输出的检测结果会被用于疾病诊治、预后判断等。因此，除了重复性和荧光灵敏度外，更关注于可能影响检测结果准确性的性能指标。为此，国家食品药品监督管理局在2005年发布了医药行业标准《YY/T0588－2005流式细胞仪》，对流式细胞仪的评价项目不仅涵盖了重复性、荧光灵敏度等基本性能，而且增加了表面标志物准确性、表面标志物重复性、携带污染率等临床医生更为关注的性能指标，并对各项性能指标的技术要求等做了明确的定义［3］。

尽管《YY/T0588－2005流式细胞仪》已经发布多年，但该标准对于仪器分辨率的具体计算方法、对各荧光通道分辨率的技术要求，以及各项评价指标的具体操作步骤描述得不够详尽，使得该标准在医学领域中未能得到广泛应用。为此，本次评价对分辨率的具体计算方法和对各通道分辨率的技术要求做了细化，对评价的具体操作过程也做了说明，为医学实验室评价流式细胞仪的性能提供了一套详尽的参考方法。

［1］Sack U，Tarnok A.Cellular diagnostics:Basic principles，methods and clinical applications of flow cytometry［M］.Basel:Karger， 2009.

［2］刘艳荣.实用流式细胞术－血液病篇［M］.北京:北京大学医学出版社，2010.

［3］国家食品药品监督管理局.YY/T0588－2005流式细胞仪［S］.北京:国家食品药品监督管理局，2005.

［4］Hoffman R.Standardization，calibration，and control in flow cytometry［M］.NJ，USA:John Wiley ＆Sons，2012.

［5］Shapiro HM.Practical flow cytometry［M］.4th ed.NJ，USA:John Wiley ＆Sons，2003.

Establishment of evaluation methods for the performance of flow cytometer

Wang Xiaolin，Li Ang，Yang Shuo
（Department of Laboratory Medicine，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China）

ObjectiveTo Establish evaluation methods for the performance of flow cytometer.MethodsReferring to the industry standard YY/T0588－2005 Flow Cytometry，evaluating methods for the performance of BriCyte E6 flow cytometry was established，such as fluorescence sensitivity，fluorescence linearity，forward scatter sensitivity，instrument resolution，forward scatter/side scattering resolution，DNA content linearity，carry－over rate，accuracy of the cell surface marker，reproducibility of the cell surface marker and instrument stability.ResultsThe performance of BriCyte E6 met the requirements of industry standard.ConclusionThe evaluation methods for the performance parameters could be reliable and could be used for the performance evaluation of flow cytometer.

flow cytometry； performance evaluation； BriCyte E6

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.020

A

1673－4130（2015）10－1366－03

2015－01－07）

王小林，男，副主任技师，主要从事临床血液及体液检验研究。