南通地区2014年肠道病毒71型的分子流行病学研究＊

张宏萍，周 敏，陆仁飞，李雪梅

（1.南通市疾病预防控制中心，江苏南通 226001；2.江苏省南通市第三人民医院，江苏南通 226001）

南通地区2014年肠道病毒71型的分子流行病学研究＊

张宏萍1，周 敏1，陆仁飞2，李雪梅2

（1.南通市疾病预防控制中心，江苏南通 226001；2.江苏省南通市第三人民医院，江苏南通 226001）

目的分析2014年江苏南通地区肠道病毒71型（EV71）的分子流行病学特征。方法采集52例手足口病患儿咽拭子标本，提取病毒核酸，采用实时荧光定量PCR（RT－PCR）扩增病毒的VP1序列。获得的序列与来自其他地区的序列进行比对分析，构建系统发育树。结果52份临床标本中分离到12株EV71 VP1序列，12株VP1序列的核苷酸、氨基酸同源性为93.4%～99.1%，进化树分析显示12株VP1序列全部属于C4基因型的C4a亚型。结论2014年南通地区分离的EV71流行病毒株与近年来中国其他地区的流行株有相同的起源，均属于EV71 C4基因的C4a亚型。

肠道病毒71型； 基因特征； 分子流行病学

肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科，肠道病毒属，其核酸为单股正链RNA，是引起婴幼儿手足口病的主要病原体，还能引起无菌性肠膜炎，脑干脑炎和骨髓灰质炎样的麻痹与多种神经系统的疾病［1］。1969年，美国加州首次报道了EV71引起的病例［2］，此后，全球各地均有流行。我国各地区对EV71流行爆发均有报道［3－5］，本研究对2014年江苏南通地区手足口病分离的EV71 VP1区进行扩增测序，旨在了解本地区近段时间EV71的流行趋势及分子流行病学特征。

1 材料与方法

1.1 材料 标本来源于2014年南通地区各医院手足口病住院患儿，采集患儿咽拭子标本于病毒储存液中，－80℃保存。1.2 引物设计 GenBank中下载EV71的基因序列，经比对选取保守序列，设计合成EV71 VP1区的巢式引物:引物F1 5′－CCC AAT ACA GCC TAT AAA－3′，R1 5′－CGA GGC TGT CTT CCC A－3′，扩增片段1 100 bp；内引物F2 5′－ACT AGC GGC AGC CCA－3′，R2 5′－CCA CTC TAA AGT TGC CCA C－3′，扩增片段1 022 bp。引物由上海捷瑞生物技术有限公司合成。

1.3 病毒核酸提取 采用北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒（磁珠吸附法），提取方法严格按照说明书。

1.4 EV71实时荧光定量PCR（RT－PCR）鉴定 使用EV71、柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒（默乐生物）鉴定标本的病毒RNA类型。严格按照说明书操作，RT－PCR阳性标本即可确诊为EV71感染标本。

1.5 EV71 VP1基因的扩增 将EV71阳性标本提取的RNA作为模板，采用one step RT－PCR kit（大连Takara公司）进行逆转录聚合酶链反应。在RT－PCR反应体系中加入外引物F1 和R1，取标本RNA 4μL，反应总体系20μL，反应条件:50℃30 min，95℃30 s，50℃30 s，72℃1.5 min，35个循环，72℃10 min。第2轮扩增:取第1步RT－PCR产物1μL为模板，进行第2轮扩增。第2轮PCR反应中加内侧引物F2、R2，反应总体系50μL，反应条件:95℃2 min，95℃30 s，55℃30 s，72 ℃70 s，30个循环，72℃10 min。PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否扩增到约1.0×103的产物，阳性结果送上海迈浦生物科技有限公司测序。

1.6 DNA序列分析 获得的VP1序列，使用MEGA 5.0软件中提供的Muscle项进行比对，并人工对序列进行校正。使用MEGA V5.0软件，对本研究中获得的序列与国内外EV71代表病毒株进行进化分析，构建系统发育树。

2 结 果

2.1 EV71 VP1片段扩增结果 对12例荧光定量PCR检测EV71核酸阳性的标本进行VP1片段扩增。电泳检测显示，各阳性标本均能在1.0×103位置出现明显目的条带。将测序获得的各标本EV71 VP1序列，分别命名为Nantong01_2014，Nantong02_2014…..Nantong12_2014。

2.2 EV71 VP1基因核苷酸、氨基酸序列同源性分析 本实验共分离到12株南通地区2014年流行的EV71，根据测序的全部12条EV71 VP1基因序列，进行同源性比对。12条序列间具有较高的同源性（93.4%～99.1%）。同源性比对结果见图2（见《国际检验医学杂志》网站论文附件）。

2.3 EV71 VP1基因系统发育树的构建和分析 为了探寻2014年南通市12株EV71病毒株的传播来源，Cox A16原型株G－10作为外群序列，搜集中国其他城市分离的EV71病毒序列和国外流行的病毒株序列，使用邻接法构建系统发育树。根据构建的系统发育树显示，中国所有的EV71病毒序列聚集在一起，位于C4亚型参考序列的内侧，与国外流行的其他亚型病毒序列有较远的进化距离。南通地区2014年分离的12 株EV71和中国其他大部分城市分离的EV71序列有更近的进化距离，并组成EV71的C4a进化簇，而来自上海2000年分离的3株病毒株则单独聚在一起，组成了EV71的C4b进化簇。在C4a进化簇中，来自南通2014年采集的12条EV71序列，根据核酸的进化距离，主要形成5个不同的进化分支或进化簇，与全国其他地区的病毒序列有很近的亲缘关系，显示南通市流行的EV71是来源于中国本地主要流行的病毒株。根据现有的序列进一步分析显示，12条南通地区的EV71序列均位于主要由江苏省病毒株组成的进化簇内。其中，8条流行于南通地区的EV71序列与镇江2010年流行的病毒序列聚集在一起或位于镇江序列的进化簇内，表明这些病毒株由镇江地区传入南通地区。剩余的4条南通EV71序列单独聚在一起，但均位于主要由江苏省序列组成的进化簇内。综上所述，南通地区2014年流行的EV71病毒株序列与江苏本省流行的EV71病毒株有更近的亲缘关系，表明南通地区2014年流行的病毒株为江苏省本省流行的病毒株。另外，南通地区2009年流行的EV71病毒序列同样与江苏省内其他城市的病毒序列聚集在一起，表明南通地区多次流行的EV71病毒株，均来自江苏省内南通地区2014年12株EV71病毒株与其他地区病毒株的系统发育关系见图3（见《国际检验医学杂志》网站论文附件）。

3 讨 论

手足口病是指手足口腔等部位出现红色斑丘疹，伴有或不伴有发热的一种急性传染病，可由多种肠道病毒感染引起，如EV71、Cox A、B型或埃可病毒等其他肠道病毒。EV71感染是引起手足口病的主要病原体，且可引起严重的中枢神经系统并发症，主要的发病人群集中在1～4岁年龄组［6－7］。VP1蛋白是EV71病毒主要的病毒抗原决定簇，是肠道病毒血清型分型的主要依据。根据VP1基因序列的差异，全球的EV71病毒株被划分为A、B和C三个基因型。除A基因型仅含有EV71原型株外，B、C基因型又可进一步划分为含有一定数量的亚型［8－10］。

根据已分离的EV71病毒株分析显示，C4亚型为中国各地区最主要流行的病毒株［11］。C4亚型的序列又主要形成两个进化分支，C4a和C4b。其中，C4b病毒株仅在少数地区的早期阶段流行，如于上海2000年分离的病毒株［12］。来自近年来中国各地区流行的病毒株序列组成了C4a分支，这是当前中国最主要流行的病毒株。在C4a分子内，不同地区和不同时间分离的序列有很近的遗传关系，表明它们来自共同的祖先。为了解EV71的亚型分布，本研究收集了2014年南通地区各医院的手足口病患儿标本，成功获取到12份EV71标本的VP1基因序列。根据构建的系统发育树显示，南通地区2014年分离的病毒株均属于C4a病毒株，表明当前南通地区流行的EV71病毒株为相同的亚型病毒株。

2008年安徽省阜阳市暴发较大规模的手足口病流行，随后山东、江苏、北京、上海等全国各地均出现了手足口病疫情。分子流行病学的分析显示，来自江苏的EV71病毒株与同时期安徽阜阳流行的病毒株聚集在C4a分支，其遗传距离较小。因此，流行在江苏相邻省市（如上海，山东）的EV71病毒应该均由阜阳传入。在本研究中，数据库中南通地区2009年的EV71病毒序列也被用于构建系统发育树，以便鉴定南通地区EV71病毒的序列差异。然而分析显示，无论是2009年分离的病毒序列还是2014年分离的病毒序列，它们相互间的遗传距离均较近，均属于C4a，显示南通地区流行单一的EV71亚型病毒株。同时，其他地区EV71序列构建的系统发育树显示，南通地区不同时期分离的病毒株均流行于江苏省内其他城市，如镇江，南通等的病毒序列聚集在一起，表明南通地区EV71的病毒株主要受流行于江苏省内的病毒株影响。然而，由于样本数量的限制，因此本研究的分析结果尚不能完全代表南通地区EV71的实际流行情况。更多样本的分析将有助于进一步了解南通地区EV71的实际流行情况。

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Enterovirus 71 molecular epidemiology research in Nantong，2014＊

Zhang Hongping1，Zhou Min1，Lu Renfei2，Li Xuemei2
（1.Nantong Center for Disease Control and Prevention，Nantong，Jiangsu 226001，China；2.Third People′s Hospital of Nantong in Jiangsu Province，Nantong，Jiangsu 226001，China）

ObjectiveTo analyze enterovirus 71（EV71）molecular epidemiology characteristics in Nantong region of Jiangsu，2014.MethodsThe pharyngeal swab samples were selected from 52 children with hand，foot and mouth disease.After extracting the virus nucleic acid，the EV71 VP1 gene of the virus were amplified by RT－PCR amplification.The phylogenetic tree was constructed between isolated and EV71 reference strains from other parts of the country.Results12 strains EV71 VP1 gene were isolated from 52 cases of clinical specimens.The nucleotide and amino acid homology of 12 strains EV71 VP1 gene was 93.4%－99.1%，the phylogenetic tree analysis showed that 12 strains of VP1 gene all belong to C4 genotype C4a subgenotypes.ConclusionThe isolated strains in Nantong in 2014 are all the EV71 C4a subgenotypes of C4 genotype，the same with the most of isolates in recent years.

Enterovirus 71； genetic traits； molecular epidemiology

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.014

A

1673－4130（2015）10－1354－03

2015－01－02）

南通市科技局资助项目（HS2013028）。 作者简介:张宏萍，女，主管检验师，主要从事微生物学检验研究。