HBV感染者调节性T淋巴细胞与细胞因子研究＊

颜晓霞，陈锡莲，李彩东，吴 斌，段正军，田鹏飞

（1.兰州市肺科医院，甘肃兰州 730046；2.兰州市第二人民医院肝病研究所，甘肃兰州 730046）

HBV感染者调节性T淋巴细胞与细胞因子研究＊

颜晓霞1，陈锡莲2△，李彩东2，吴 斌2，段正军2，田鹏飞2

（1.兰州市肺科医院，甘肃兰州 730046；2.兰州市第二人民医院肝病研究所，甘肃兰州 730046）

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）e抗原（HBe Ag）阳性及阴性HBV感染者外周血CD4＋CD25＋调节性T淋巴细胞（Treg）、白细胞介素－18、γ－干扰素、转化生长因子β表达水平及临床意义。方法将175例HBV感染患者分为慢性乙型肝炎（CHB）组和慢性无症状HBV携带者（ASC）组，各组再分为HBe Ag（＋）组和HBe Ag（－）组，检测外周血CD4＋CD25＋Treg、细胞因子及肝功能指标的水平。以健康者作为对照组。结果HBeAg（＋）与HBeAg（－）ASC组和CHB组CD4＋CD25＋Treg表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；HBe Ag（＋）与HBe Ag（－）ASC组和CHB组细胞因子表达水平较对照组明显升高（P＜0.05）；HBeAg（＋）ASC组外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转基酶/血小板比值呈正相关（P＜0.05）。结论CD4＋CD25＋Treg和细胞因子在乙型肝炎慢性化过程中起重要作用；CD4＋CD25＋Treg表达水平与肝炎的炎性反应程度有一定关系。

乙型病毒性肝炎； 调节性T淋巴细胞； 细胞因子； 乙肝e抗原

乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后，并不直接引起肝细胞损伤，而是诱导T淋巴细胞及部分细胞因子介导的免疫反应间接损伤肝细胞［1］。CD4＋CD25＋调节性T淋巴细胞（Treg）是具有自身免疫功能和免疫抑制性的CD4＋T淋巴细胞亚群，通过抑制CD8＋T淋巴细胞的增殖及活化，调控机体对HBV的免疫应答［2］。辅助性T淋巴细胞（Th细胞）产生的Th1/Th2型细胞因子有可能参与了慢性乙型肝炎（CHB）的发病机制。Th1型细胞因子有白细胞介素－18（IL－18）、γ－干扰素（IFN－γ）等，Th2型细胞因子有转化生长因子－β（TGF－β）、白细胞介素－10（IL－10）等［3］。本研究旨在探讨HBV e抗原（HBe Ag）阳性［HBeAg（＋）］与HBe Ag（－）慢性HBV感染者CD4＋CD25＋Treg、IL－18、IFN－γ、TGF－β表达水平及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年7～12月在兰州市第二人民医院就诊的HBV感染者175例，男95例、女性80例，年龄11～66岁，平均（39.38±12.72）岁，符合《慢性乙型肝炎诊治指南》中的诊断标准［4］；所有患者均未接受免疫调节和抗病毒治疗，6个月内未接受保肝治疗，排除甲、丙、丁、戊等肝炎病毒感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎等疾病。175例患者中，CHB患者63例（CHB组），其中HBe Ag（＋）30例，HBeAg（－）33例；慢性无症状HBV携带者（ASC）112例（ASC组），其中HBe Ag（＋）24例，HBe Ag（－）88例。同期体检健康者50例纳入对照组，男25例、女25例，年龄23～58岁，平均（38.68±13.01）岁。

1.2 方法

1.2.1 CD4＋CD25＋Treg检测 采集受试者乙二胺四乙酸二钾抗凝空腹外周血2 m L，取50μL抗凝血，加入20μL单抗（CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP），振荡混匀，室温避光孵育20min；加入2 m L溶血素，振荡混匀，室温避光放置15 min；1 500 r/min离心5 min，弃上清液；加入2 m L磷酸盐缓冲液（PBS），1 500 r/min离心5 min，弃上清液，重复一次；加入500μL PBS，采用美国BD公司流式细胞仪、配套试剂进行细胞标记物检测，采用FAC Suite软件获取和分析荧光参数。

1.2.2 细胞因子检测 采集受试者外周血，常规方法分离血清标本，采用美国RD公司酶联免疫法试剂盒及科华公司ST－360酶标仪进行IL－18、IFN－γ、TGF－β检测。操作步骤参照试剂盒及仪器说明书。

1.2.3 外周血其他指标检测 采集受试者外周血，常规方法分离血清标本，采用美国贝克曼公司AU－680全自动生化分析仪及配套试剂进行丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）检测。常规方法进行血小板（PLT）检测。操作步骤参照试剂盒及仪器说明书。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据处理和统计学分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，组内相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为比较差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CD4＋CD25＋Treg、细胞因子检测结果 （1）HBe Ag（＋）和HBe Ag（－）ASC患者外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），IL－18、IFN－γ及TGF－β水平则明显升高（P＜0.05），见表1。（2）HBe Ag（＋）与HBe Ag（－）CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平变与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），IL－18、IFN－γ及TGF－β水平则明显升高（P＜0.05），但HBe Ag（＋）与HBe Ag（－）组间IL－18、IFN－γ和TGF－β水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.2 CD4＋CD25＋Treg表达水平与肝功能相关性分析 （1）HBeAg（＋）ASC组外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与ALT、AST/PLT（A/P）呈正相关（P＜0.05）；HBe Ag（－）ASC组外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与ALT、AST、TBIL、A/P均无相关性（P＞0.05），见表3。（2）HBe Ag（＋）及HBeAg（－）CHB组外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与ALT、AST、TBIL、A/P均无相关性（P＞0.05），见表4。

表1 ASC患者、健康者外周血CD4＋CD25＋Treg、细胞因子检测结果（）

＊:P＜0.05，与对照组比较。

组别n CD4＋CD25＋Treg（%）IL－18（ng/m L）IFN－γ（ng/m L）TGF－β（ng/m L）HBeAg（＋）24 26.18±15.86 590.39±80.98＊190.92±55.49＊359.43±76.19＊HBe Ag（－）88 28.72±13.06 506.56±91.68＊208.75±48.89＊329.63±67.82＊对照组50 27.30±14.59 49.79±14.68 14.41±4.75 42.28±13.50

表2 CHB患者、健康者外周血CD4＋CD25＋Treg、细胞因子检测结果（）

＊:P＜0.05，与对照组比较。

组别n CD4＋CD25＋Treg（%）IL－18（ng/m L）IFN－γ（ng/m L）TGF－β（ng/m L）HBe Ag（＋）30 30.48±19.12 425.67±83.47＊177.91±28.13＊315.69±70.95＊HBeAg（－）33 31.42±18.58 469.27±77.89＊202.76±29.65＊345.33±62.28＊对照组50 27.30±17.59 49.79±15.68 14.41±8.75 42.28±13.50

表3 ASC患者外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与肝功能相关性（）

＊:与HBe Ag（＋）患者CD4＋CD25＋Treg表达水平的相关系数；#:与HBe Ag（－）患者CD4＋CD25＋Treg表达水平的相关系数；－:无数据。

组别n ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）A/P HBe Ag（＋）24 29.12±7.57 33.50±23.42 17.08±8.44 1.68±1.62 HBeAg（－）88 25.52±9.46 31.82±12.55 30.75±69.69 0.52±0.60 r －0.49＊0.11#0.03＊0.05#－0.08＊－0.14#1.00＊0.07#P－＜0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05

表4 CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与肝功能相关性（）

＊:与HBe Ag（＋）患者CD4＋CD25＋Treg表达水平的相关系数；#:与HBe Ag（－）患者CD4＋CD25＋Treg表达水平的相关系数；－:无数据。

组别n ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）A/P HBe Ag（＋）30 366.70±95.94 318.93±82.45 71.09±44.55 3.31±2.63 HBeAg（－）33 180.94±59.16 111.64±59.24 61.09±34.94 1.32±1.01 r －0.12＊0.33#0.17＊0.30#0.09＊0.14#0.01＊0.02#P－＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

3 讨 论

CHB发病机制极其复杂，目前普遍认为宿主免疫调节紊乱是其发病及病理损伤的主要原因［5］。在免疫反应过程中，各种免疫细胞和细胞因子参与免疫应答，形成免疫调节网络，是宿主抵御病毒感染的重要因素。

CD4＋CD25＋Treg是具有免疫抑制功能的抑制性T淋巴细胞群［6］，在健康者体内，生理性CD4＋CD25＋Treg约占CD4＋T淋巴细胞总数的5%～10%，以免疫负向调节的方式抑制自身反应性T淋巴细胞的作用，对多种刺激呈低反应状态，对于维持免疫系统稳态及免疫耐受具有重要作用，可通过非抗原特异性方式抑制免疫系统的功能，但具体的作用机制尚不完全清楚［7］。Stoop等［8］发现，CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg数量较健康者增多，去除CD4＋CD25＋Treg后，HBV特异性增殖反应增强。本研究发现，与健康者相比，HBe Ag（＋）与HBeAg（－）ASC患者和HBe Ag（＋）与HBeAg（－）CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。同时，HBe Ag（＋）与HBeAg（－）CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平较健康者有升高趋势，提示CD4＋CD25＋Treg可通过抑制效应细胞的增殖，调控机体对HBV感染的免疫应答，增强抗病毒免疫反应，促进病毒的清除。

细胞因子作为宿主产生的重要炎性反应调节介质，在清除HBV的免疫应答过程中发挥重要的作用。Th1/Th2型细胞因子具有相互调节、相互制约的作用，共同调节机体的免疫状态。正常情况下，Th1/Th2处于动态平衡状态，如果Th1/Th2失衡，可能导致免疫功能紊乱，影响免疫防御功能。与健康者相比，HBeAg（＋）与HBe Ag（－）ASC患者和HBe Ag（＋）与HBe Ag（－）CHB患者外周血IL－18、IFN－γ及TGF－β水平明显升高（P＜0.05），提示IL－18、IFN－γ及TGF－β可能参与了CHB的发病过程，与何登明等［9］的报道一致。此外，HBe Ag（＋）ASC患者外周血TGF－β水平高于HBeAg（－）ASC患者，原因可能是TGF－β表达增加，促进受损肝细胞、内皮细胞对PLT的聚集作用，进而释放更多的TGF－β。

关于CD4＋CD25＋Treg表达水平与ALT水平的关系，Lin等［10］认为肝细胞损伤可增强CHB患者CD4＋CD25＋Treg的抑制活性，其研究显示，外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与ALT水平呈正比，去除CD4＋CD25＋Treg后，ALT水平较高的患者HBV特异性CD8＋T淋巴细胞的增殖反应明显高于ALT水平较低的患者。但国内有研究显示，外周血CD4＋CD25＋Treg表达水平与血清ALT水平无相关性［11］。本研究发现，HBeAg（＋）ASC患者CD4＋CD25＋Treg与A/P呈正相关（P＜0.05），提示ASC患者体内HBV的增殖激活了细胞免疫，通过攻击自身被感染了HBV的肝细胞，引起肝细胞损伤，表现为ALT、AST、TBIL、A/P升高，而长期的慢性炎症导致肝细胞不断被破坏与修复，逐渐出现肝纤维化，进而可能发展为肝硬化和肝癌。本研究还发现，HBe Ag（＋）ASC患者CD4＋CD25＋Treg表达水平与外周血ALT水平呈正相关（P＜0.05），说明CD4＋CD25＋Treg表达水平与肝炎的炎性反应程度有一定关系，CD4＋CD25＋Treg对免疫稳态具有重要的调节作用。

综上所述，各种T淋巴细胞和细胞因子之间的作用不是相互孤立的，而是协调、有序的整体，构成统一的网络，相互协调又相互拮抗，保护机体，抵抗侵袭，维持正常的免疫应答。因此，监测IL－18、IFN－γ、TGF－β水平的变化在判断CHB患者病毒复制活跃程度、病情进展、预后及指导治疗方面具有一定意义。

［1］肖光明，姚细安，连粤湘，等.乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群的变化［J］.实用肝脏病杂志，2005，8（1）:22－24.

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Research of Treg and cytokines in patients with hepatitis B virus infection＊

Yan Xiaoxia1，Chen Xilian2△，Li Caidong2，Wu Bin2，Duan Zhengjun2，Tian Pengfei2
（1.Pulmonary Hospital，Lanzhou，Gansu 730046，China；2.Liver Diseases Research Institute，Lanzhou Municipal Second People′s Hospital，Lanzhou，Gansu 730046，China）

ObjectiveTo investigate the value and clinical significance of CD4＋CD25＋regulatory T cells（Treg），inteleukin－18，interferon－γand transforming growth factor－βin patients with hepatitis B virus（HBV）infection.MethodsA total of 175 patients with HBV infection were divided into chronic type B hepatitis（CHB）group and chronic asympotomatic HBV carrier（ASC）group，which were further divided into hepatitis B e antigen（HBe Ag）positive and negative groups.CD4＋CD25＋Treg，cytokines levels and liver function were measured.Healthy subjects were enrolled into control group.ResultsProportion of CD4＋CD25＋Treg were without significant difference among healthy controls，HBe Ag（＋）and HBe Ag（－）ASC groups，and HBe Ag（＋）and HBe Ag（－）CHB groups（P＞0.05）.Compared with control group，cytokines levels were significant higer in CHB and ASC group（P＜0.05）.CD4＋CD25＋Treg level was significant positive correlation to alanine aminotransferase and ratio of aspartate aminotransferase to plateles in HBeAg（＋）ASC group（P＜0.05）.ConclusionCD4＋CD25＋Treg and related cytokines could play important roles in the course of CHB，while CD4＋CD25＋Treg expressing might be correlated with inflammatory degree of hepatitis.

viral hepatitis type B； T regulatory cells； cytokines； hepatitis B e antigen

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.011

A

1673－4130（2015）10－1346－03

2015－03－02）

甘肃省兰州市科技局科技发展指导性计划项目（2013－ZD－06）。 作者简介:颜晓霞，女，副主任医师，主要从事呼吸内科研究。△

，Email:tracychen2006＠126.com。