反相高效液相色谱法测定加味藿香正气丸中橙皮苷含量的研究

钱 方，薛非凡

（襄阳市食品药品监督管理局 食品药品检验所， 湖北 襄阳 441021）

加味藿香正气丸为水蜜丸，处方由广藿香、紫苏叶、白芷、白术（炒）、陈皮、半夏（制）、厚朴（姜制）、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、大枣和生姜组成。功能与主治为解表化湿、理气和中。用于外感风寒、内伤湿滞、头痛昏重、胸膈痞闷、院腹胀痛、呕吐泄泻。原标准无含量测定，以其水溶性成分橙皮苷作为控制指标进行含量测定建立分析方法。［1-8］主峰与杂质峰达到基线分离，峰形较好，阴性无干扰。对含量测定方法进行阴性试验、线性关系、稳定性、重复性、回收率等方法学验证，结果表明该方法可行，重现性好。通过对多批样品的含量测定，拟定了本品适当的含量测定限度，结果表明所制订的制剂质量标准专属性强，可控性好，可以更好地控制内在质量，使本品质量控制指标更加完善。

一、仪器与试药

岛津LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10AVP紫外检测器，CBM-102工作站；CP-225D电子天平由北京赛多利斯仪器系统有限公司提供；KQ-100B超声波清洗仪由昆山市超声仪器有限公司提供。皮苷对照品（批号为110721-200512），供含量测定用，购于中国药品生物制品检定所；加味藿香正气丸由珠海正太制药有限公司提供，批号为20120402、20120501、20120502、20120503、20120504、20120505、20120506、20120601、20120602、20120603； 冰醋酸为分析纯，甲醇为色谱纯。

二、方法与结果

（一）色谱条件与系统适用性试验

使用Kromasil ODS-2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）为色谱柱；甲醇-0.5%冰醋酸（40：60）为流动相；检测波长为283 nm，流速为1 ml/min，柱温为室温（25℃），进样量 5 μl。

（二）溶液的制备

1.对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml含25 μg的溶液，即得。

2.供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取细粉0.3 g，精密称定，精密加甲醇50 ml，称定重量，水浴回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.阴性样品溶液的制备：取不含陈皮的阴性样品约0.3 g，精密称定，照供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

（三）测定波长的选择

取橙皮苷对照品溶液，于紫外分光光度计上扫描测定，结果在283.6 nm波长处有最大吸收，参考中国药典2010年版一部健胃消食片含量测定项下橙皮苷的测定波长，选用283 nm作为测定波长。

（四）阴性试验（专属性）

分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5 μl，分别注入液相色谱仪，结果阴性样品液在橙皮苷峰相应位置，未见色谱峰（见图1），表明阴性样品无干扰，该方法可用于本品橙皮苷含量的测定。

图1 加味藿香正气丸的反相高效液相色谱

（五）线性关系的考察

精密称取橙皮苷对照品0.012 2 g，置100 ml量瓶中，使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取此对照品溶液 5 ml、10 ml、5 ml、5 ml、5 ml， 分别置于 10 ml、25 ml、25 ml、50 ml、10 0ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成 61.0 μg/ml、48.8 μg/ml、24.4 μg/ml、12.2 μg/ml、6.1 μg/ml 浓度的对照品溶液，吸取上述溶液各5 μl，注入色谱仪，测定， 以橙皮苷进样量（0.030 5、0.061、0.122、0.244、0.305 μg） 为横坐标值， 峰面积（46 488、93 426、177 117、348 540、439 985）为纵坐标值，进行线性回归，得回归方程Y=141 966X+4 261.367，相关系数γ=0.999 9。考察结果表明，橙皮苷在0.030 5～0.305 μg的进样量范围内与峰面积呈良好的线性相关。

（六）精密度试验

取一定浓度（24.4 μg/ml）的对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积分别为179 049、177 263、175 279、178 288、178 097、179 133， 平均峰面积为177 851.5，考察精密度，RSD=0.81%，结果表明，精密度良好。

（七）稳定性试验

取同一样品 （批号20120401）在不同时间点（10：42、13：07、14：58、16：11、17：27、18：26）进样测定，测得峰面积（171 419、168 284、169 982、166 282、167 558、167 196）的 RSD（0.83%），结果表明，供试品溶液在8 h内保持稳定，能保证测定的时间要求。

（八）重复性试验

取同一批样品（批号20120401）6份，取样量分别为 0.316 8、0.308 5、0.309 4、0.319 1、0.312 2、0.316 7g，按标准正文所述方法测定各份含量分别为6.90、6.89、6.87、6.82、6.91、6.89 mg/g，平均值 6.88±0.47%，以考察测定方法的重复性（RSD=0.81%），结果表明，本方法的重复性良好。

（九）回收率试验

取已知含量（批号20120401）的样品（含量为6.9 mg/g）6份， 分别精密加入24.8 μg/ml的橙皮苷对照品溶液50 ml（取对照品0.012 4 g加甲醇定容至500 ml，即得24.8 μg/ml的橙皮苷对照品溶液），按标准所述方法测定含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加味藿香正气丸的回收率测定

本方法的回收率为（98.0±0.65）%（n=6），表 1结果表明回收率良好。

（十）耐用性试验

改变流动相中有机相的量（±5%），流动相的PH（±0.2 PH），柱温（25 ℃，40 ℃），流速（±0.2 ml）对结果的影响，结果显示：改变流动相中有机相的量，PH值，柱温，流速对结果几乎无影响，说明耐用性较好。

三、样品含量的测定与含量限度

取样品10批，照标准正文中所述方法测定含量，结果见表2。

表2 加味藿香正气丸的含量测定

本品处方中陈皮直接粉碎入药，处方总量990 g，其中含陈皮100 g，加入炼蜜约480 g，最后的成品约 1 200 g，2010版药典规定陈皮中橙皮苷（C28H34O15）的含量不得低于 3.5%，100*3.5%*1 000/1 200=2.9 mg/g，故拟定本品含量限度为：本品每1 g含陈皮以橙皮苷（C28H34O15）计，不得少于2.8 mg。

四、讨论

1.流动相的选择：参考相关文献，以甲醇-0.5%冰醋酸（40：60）进行初试验，保留时间适中，橙皮苷峰与相邻色谱峰完全分离，分离度大于2.0，柱效较高，并有效地节省了检验时间。故选用甲醇-0.5%冰醋酸（40：60）为流动相，流速 l ml/min，柱温为室温，理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2 000。

2.提取时间的选择：取本品装量差异项下的内容物，研细，取细粉（0.325 4、0.327 7、0.320 1 g），精密称定，精密加甲醇约50 ml，称定重量，分别置水浴上回流处理 1 h、2 h、3 h，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液进样，测得各份样品的含量（6.5、6.9、6.9 mg/g），结果表明，水浴上回流处理2 h即提取完全，故选择提取时间2 h。

3.含量测定方法的选择：文献报道含量测定方法较多，如高效液相色谱测定加味藿香正气丸中橙皮苷的含量，［1］高效液相色谱法测定藿香正气胶囊中橙皮苷的含量，［2］HPLC法测定藿香正气软胶囊中橙皮苷的含量，［3］RP-HPLC法测定藿香正气片中橙皮苷的含量，［9］高效液相色谱法测定藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚含量，［10］包括了所有制剂。制剂的含量测定方法文献报道也多，如气相色谱测定加味藿香正气丸中百秋李醇的含量，［6］加味藿香正气丸中厚朴酚与和厚朴酚含量测定，［5］HPLC法测定加味藿香正气丸中甘草酸的含量，［8］高效液相色谱测定加味藿香正气丸中橙皮苷的含量，［11］气相色谱测定需将被测成分气化后测定，液相色谱测定被测成分不需气化（破坏），故选液相色谱测定；加味藿香正气丸其水溶性成分橙皮苷具有温胃散寒、理气健脾的功效，较其他成分更能代表药效成分，故选橙皮苷为药效成分。在高效液相色谱测定橙皮苷的含量中，流动相种类较多，如乙腈-酸水，其中酸有磷酸、乙酸、三氟乙酸、冰醋酸，酸的浓度有0.2%、0.3%、0.5%等；又如甲醇-酸水，其中酸有磷酸、乙酸、三氟乙酸、冰醋酸，酸的浓度有0.2%、0.3%、0.5%等；还有乙腈-乙酸-水、甲醇-乙酸-水。本文选用甲醇-0.5%冰醋酸（40：60）为流动相，主峰与杂质峰达到基线分离，峰形较好，阴性无干扰。

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