灰霉菌胁迫下水杨酸对拟南芥抗氧化酶的影响



灰霉菌胁迫下水杨酸对拟南芥抗氧化酶的影响

刘 云 鹏，伍琳，王静*

(包头师范学院 生物科学与技术学院，内蒙古 包头014030)

摘要：本研究用100umol/L的水杨酸对拟南芥幼苗进行预处理，24h后用6×105个/mL的孢子悬液侵染拟南芥幼苗，测定灰霉菌侵染后拟南芥幼苗内SOD，POD，CAT活性，MDA的含量，旨在探讨外源SA对拟南芥抵抗灰霉菌胁迫的影响，为进一步深入研究植物抗逆诱导剂及抗逆分子机理提供有利帮助。

关键词：水杨酸；灰霉菌；抗氧化酶；拟南芥

灰霉菌(Botrytiscinerea)，属半知菌亚门真菌，寄生的植物超过200种[1]。灰霉孢子可寄生在拟南芥叶片上，其菌丝可穿透叶片表皮细胞，侵入到叶片内吸收寄主营养。水杨酸(salicylic acid, SA)，即邻羟基苯甲酸, 是一种简单的酚类化合物, 在植物体内作为内源信号分子参与多种代谢的调节[2]，是一种新型的植物激素。水杨酸在植物抗逆生理中发挥着重要作用，它能够通过调节抗氧化酶的活性来提高植物对逆境胁迫(如冷、热、盐、干旱、重金属等)的抵抗能力[3]。

1材料与方法

1.1　灰霉菌的培养

本实验用土豆培养基培养灰霉菌[4]。将接好菌的培养管于恒温恒湿培养箱中，23℃培养15d，每隔5d拍一次照。

1.2　拟南芥的分装及喷施水杨酸

将生长16天的拟南芥分装成对照组和喷水杨酸组(每组分为2、4、6、8天四个小组，每小组设不进行胁迫的对照)，选择两个不同的地点，分别对其喷施蒸馏水和100umol/L的水杨酸。喷施后，将拟南芥放回植物培养架上继续培养24h[5]。

1.3　灰霉菌侵染实验

(1)将漏斗(漏口塞住脱脂棉)，玻璃棒，移液枪枪头，锥形瓶(100mL)于121℃，0.103MPa下灭菌20min。

(2)取三支长有灰霉菌的试管，向第一支试管中加入2mL无菌水，将玻璃棒灼烧，贴壁冷却后，刮掉培养基斜面上的菌丝和孢子，使孢子充分悬浮到水中。

(3)将悬液倒入另外一支灰霉菌试管中，加入1mL无菌水，重复以上操作，第三支也同上。

(4)把漏斗插入锥形瓶中，堵住出口的脱脂棉用无菌水浸润，将第三支试管内的孢子悬液倒入其中，使孢子悬液过滤至锥形瓶中，用封口膜将锥形瓶的口密封。

(5)用血球计数板在相差显微镜下对孢子进行计数。

(6)用无菌水将其稀释成600个孢子/uL的悬液。

(7)用0.5-10uL的移液枪分别吸取5uL灰霉菌孢子悬液于预处理24h后的拟南芥的第一片真叶上。

1.4　SOD,POD,CAT活性的测定

称取0.5g叶片，用液氮研磨，倒入10mL的离心管中，加入62.5mmol/l，PH7.8的磷酸缓冲液5mL，分装于2ml EP管中于CT14RD型离心机1000 r/min，4℃下离心20 min，上清液即为酶提取液。

SOD活性的测定测定方法参见刘祖祺和张石城(1994)[6]。酶反应体系加样顺序：62.5mmol/L，PH=7.8的磷酸缓冲液2.4mL，0.06mmol/L的核黄素0.2mL，30mmol/L的蛋氨酸0.2mL，0.003mmol/L的EDTA 0.1mL，待测酶液20uL，1.125mmol/L的氮蓝四唑(NBT)0.2mL。以不加待测酶液(用PBS替代)的管为最大光还原管，不加NBT(用PBS替代)的管为空白对照，每组重复四次，然后于4000lux下反应25min，反应液在波长为560nm处测其吸光值(用空白对照调零)，以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位(U)。

SOD活性(U/gFW/min)=(ACK-AE)×V/0.5×ACK×W×Vt×t

(ACK为最大光还原管的吸光度；AE为测定管的吸光度；V为酶液的总体积，mL；Vt为测定时酶液的用量，mL；W为叶片鲜重，g；t为反应时间，min)。

POD活性的测定 测定方法参见袁朝兴和丁静(1990)[7]。反应系统：4.0mL愈创木酚溶液，100uL待测酶液和400uL 30%的H2O2。加入H2O21min后比色(波长470nm)，对照以PBS(PH=6.0)代替酶液，每组重复四次，每分钟OD470增加0.01为一个酶活性单位(U)。

POD活性(U/gFW/min)=△A470×VT/W×Vs×0.01×t

(△A470为反应时间内OD470的变化；VT为酶液总体积，mL；Vs为测定时酶液的用量，mL；W为叶片鲜重，g；t为反应时间，min)。

CAT活性的测定测定方法参见李柏林和梅慧生(1989)[8]。5mL反应液为PBS 50mmol/L，H2O28mmol/L以及100uL待测酶液。以PBS(PH=7.0)代替酶液作空白对照，30℃下反应1min，加2mL 10%的H2SO4终止反应，每组重复四次。用2mmol/L KMnO4滴定剩余的H2O2，根据H2O2的消失量计算CAT活性。

CAT活性(umol/gFW/min)=(VCK-VE)×5×50/W

(VCK为空白对照所消耗KMnO4溶液的体积，mL；VE为各测定组所消耗KMnO4溶液的体积，mL；W为叶片鲜重，g)。

1.5　丙二醛含量的测定

测定方法参见刘祖祺和张石城(1994)[9]。取离心所得上清液2mL于具塞试管中，加入2ml PBS(62.5mmol/L，PH=7.8)，4mL 10%的三氯乙酸(含0.5%的硫代巴比妥酸)，混匀，盖盖儿，煮沸15min，快速冷却，4000r/min离心(4℃)20min，用10%的三氯乙酸溶液为对照，上清液于450nm、532nm、600nm处测其OD值。

MDA(umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56 OD450

求出提取液中MDA的浓度，根据叶片鲜重计算MDA在幼苗中的含量(umol/g)。

2结果与分析

2.1　SOD活性的测定结果

如图1所示，灰霉菌胁迫前4天，拟南芥幼苗的SOD活性逐渐增加，在第4天时达到最高，之后逐渐下降。灰霉菌胁迫下，喷SA组拟南芥幼苗的SOD活性均高于喷水对照的，第2天，喷SA组幼苗SOD的活性比喷水对照高61.81%，差异极显著；第6天，喷SA组幼苗SOD的活性比喷水对照高10.99%，差异显著。

图1:拟南芥幼苗在灰霉菌胁迫下体内超氧化物歧化酶活性的变化

由图2可以看出，灰霉菌胁迫前6天，拟南芥幼苗的POD活性逐渐增加，到第6天时达到最高值，之后随着胁迫时间的延长而下降。

灰霉菌胁迫下，喷SA组拟南芥幼苗的POD活性均高于喷水对照的，第2天，喷SA组拟南芥幼苗的POD活性比喷水的对照高30.67%，差异显著(P<0.05)；第6天，喷SA组幼苗的POD活性比喷水对照高26.67%，差异极显著(P<0.01)。

图2:拟南芥幼苗在灰霉菌胁迫下体内过氧化物酶活性的变化

2.3　CAT活性的测定结果

由图3可以看出，拟南芥幼苗的CAT对灰霉菌胁迫响应很快，第2天CAT活性即达到峰值，之后逐渐下降。

灰霉菌胁迫下，喷SA组幼苗的CAT活性高于喷水对照。第2天，喷SA组幼苗的CAT活性比喷水对照高70.8%，差异极显著(P<0.01)。

图3:拟南芥幼苗灰霉菌胁迫下体内过氧化氢酶活性的变化

2.4　MDA含量的测定结果

由图4中可以看出，灰霉菌胁迫下，MDA含量逐渐增加，未经胁迫的拟南芥幼苗MDA的含量基本保持稳定。

灰霉菌胁迫下，经水杨酸预处理的拟南芥幼苗体内MDA的含量比喷水对照的低。

图4:灰霉菌胁迫下拟南芥幼苗中丙二醛含量的变化

3结论

灰霉菌胁迫下，喷SA组拟南芥幼苗中三种酶的活性均高于喷水对照，丙二醛的含量均低于喷水对照，说明水杨酸能通过诱导拟南芥幼苗抗氧化酶活性的提高来增强其抵抗灰霉菌胁迫的能力，缓解灰霉菌胁迫对植株带来的伤害。

〔参考文献〕

[1]赵福庚,何龙飞,罗庆云.植物逆境生理生态学[M].北京:北京工业出版社,2004.78-134.

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[4]王关林,方宏筠.植物基因工程[M].北京:科学出版社,2002.195.

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[7]薛传华.朱砂叶螨酯酶基因克隆及其mRNA表达研究[D].重庆:西南大学,2008.

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[9]Schmittgen TD, Zakrajsek BA.Effect of Experimental Treatment on Housekeeping Gene Expression: Validation by Real-time Quantitative RT-PCR[J].J.Biochem.Biophys.Methods,2000,46:69-81.

Effect of Salicylic Acid on Several Antioxidant Enzymes of Arabidopsis Thaliana under Botrytis Cinerea Stress

LIU Yun-peng, WU Lin, WANG Jing

(Faculty of Biology and Biotechnology, Baotou Teachers College, Baotou 014030)

Abstract:In this study, Arabidopsis seedlings were pretreated with 100umol / L salicylic acid.After 24 hours, we used solution of botrytis cinerea to infect the Arabidopsis seedlings.Then we determined the activity of SOD, POD, CAT seedlings and the contents of MDA in Arabidopsis.We did this in order to investigate the effect of SA on Arabidopsis seedlings under botrytis cinerea stress and make a progress on plant defense inducers and molecular Mechanisms of resilience.

Key words:Salicylic acid; Botrytis cinerea; Antioxidant Enzyme; Arabidopsis thaliana

中图分类号：Q945.3

文献标识码：A

文章编号：1004-1869(2015)02-0022-04

作者简介：刘云鹏(1988-)，内蒙古武川县人，硕士研究生，研究方向：抗逆分子生物学。

基金项目：内蒙古自治区科学基金面上项目(2010MS0522)。

收稿日期：2014-11-04