新型水凝胶对三氯生的缓释及抗菌性能研究

刘珍珍 杨丽萍 陈能 王文荣 广东省医疗器械质量监督检验所三水中心 （佛山 528137）

三氯生，学名“二氯苯氧氯酚”，化学分子式为C12H7Cl3O2，又名“三氯新”、“三氯沙”等，是一种广谱抗菌剂，被广泛用作化妆品、洗涤剂、医疗消毒及卫生保健产品的活性成分等[1]。因其对皮肤无刺激性和较低的细胞毒性，目前三氯生多是通过乳膏的形式进行皮肤疾病的治疗[2]。

但是，三氯生是疏水性抗菌剂且容易失活，在水凝胶基质中容易聚集，从而导致生物利用率降低[3]。因此，如何将疏水的三氯生均匀分散到亲水性水凝胶基质中，是三氯生在临床应用中面临的难题。目前的三氯生乳膏多是通过添加甘油、乙二醇等增溶剂增加其溶解性，仍难以解决持续释放三氯生以及提高其稳定性的目的。而且，乙二醇等添加剂会产生神经毒性[4]。

利用两亲性Pluronic F-88 聚合物在水溶液中负载疏水的三氯生，然后再与环糊精相互作用制备原位包埋三氯生的超分子水凝胶。该水凝胶具备优异的生物相容性和触变性能[5]，且对三氯生有缓释效果，并长时间保持三氯生的活性。

1.原料与试剂

Pluronic F-88（聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇，EO103-PO40-EO103）：Sigma 公司，纯度 ≥ 99%；α-环糊精（α-CD）：日本TCI 公司，纯度 ≥ 99%；三氯生（二氯苯氧氯酚，TC）：日本TCI公司，纯度 ≥ 98%；其他试剂购自广州齐云生物科技有限公司，均为分析纯。

2.载三氯生水凝胶的制备及表征

2.1 制备方法

将2.0 g F-88 溶解于30 mL 水中，然后在冰浴条件下逐滴滴加20 mL 含TC 的丙酮溶液（1 mg/mL）。待滴加完成后将冰浴撤掉，室温条件下搅拌4 小时后于37 ˚C 继续水浴震荡24 小时，得到澄清透明溶液。将此溶液室温条件下旋转蒸发至体积减少至30 mL，用0.45 µm 过滤头过滤，得到载TC 的胶束（F-88/TC）。通过紫外—可见分光光度计测定样品在282 nm 处的吸光度值[6]，从而计算胶束对TC 的负载量为52.4 mg/g。

将所得F-88/TC 胶束与一定浓度（10、12 或14%）的α-CD 溶液等体积混合，室温条件下静置过夜，即可得到负载TC 的超分子水凝胶。

2.2 水凝胶物理性质表征

为表征凝胶样品的触变性，对其进行稳态剪切扫描和剪切跃迁扫描表征。将凝胶样品置于TA ARES/RFS 高级流变扩展系统，于50 mm 平行板夹具和25˚C 条件下进行测试。测定样品剪切粘度时，设定剪切速率范围为10—0.01 s-1；测定样品的触变行为时，设定剪切速率在10 s-1和0.1 s-1条件下交替变化。

2.3 三氯生的体外释放测定

将100 μL 负载TC 的超分子水凝胶加入800 μL PBS（0.01 M, pH = 7.4）缓冲溶液中，置于37˚C 的水浴中进行体外释放实验。每隔一段时间，从上层清液中小心取出200 μL 释放液，然后将新鲜的200 μL PBS 缓冲溶液补加到烧杯中。取出的释放液用200 转/分钟的转速离心分离，除去释放液中的悬浮物。TC 的含量通过紫外—可见分光光度计测得，标准曲线R2> 0.999。

2.4 抗菌实验

2.4.1 微生物生长曲线

用LB 培养基将载抗菌剂的凝胶配制成TC浓度为50 ppm 的悬浊液，并且配制空白对照样。在无菌室将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别从斜面刮下，转接入已灭菌好的10 mL 培养液中。37˚C 下恒温活化8 h，然后取出2.5 mL 转接入含有50mL 培养液的锥形瓶中，继续活化2h。用0.8 wt.%的生理盐水离心洗涤三次，并且稀释成一定浓度的菌样。将菌样加入装有30mL 待测样品的锥形瓶中。在37˚C 下恒温培养，定时取样测量。利用紫外—可见分光光度计测量样品在600 nm 处的吸光度值，从而得到细菌的菌量。

2.4.2 抑菌圈实验

称取牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、琼脂2 g 溶于100 mL 蒸馏水中，加热融化，待溶液冷至室温时，用1.0 mol/L 的NaOH 溶液调pH 至7.2，高压灭菌约30 min。待溶液冷却至约50˚C，分别加入大肠杆菌种和金黄色葡萄球菌种，冷却形成固体培养基。利用打洞法注入水凝胶样品（水凝胶样品事先冰箱保存一个月），于37˚C恒温下培养30 h，观察抑菌圈大小。

3.结果与讨论

Pluronic F-88 是一类聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇两亲性嵌段聚合物，该类嵌段聚合物在水溶液中可自组装形成胶束，胶束的核可负载疏水药物TC，胶束的壳因为聚乙二醇链段的存在，可以与α-CD 发生主客体作用形成水凝胶[5]。

图1. 不同α-CD 含量的水凝胶的剪切粘度随剪切速率的变化曲线

图2. 含6.0% α-CD 的水凝胶的触变测试结果

图3. 不同α-CD 含量的水凝胶对TC 的体外释放曲线

该类超分子水凝胶属于物理凝胶，可被外加的机械作用力破坏，从而导致凝胶的网络结构遭到破坏，凝胶发生流动；而当外力撤去后，其结晶结构又可恢复到起始状态。该水凝胶的这种触变行为使其在医用敷料、可注射药物载体等领域有广阔的应用前景[7]。为研究α-CD 浓度对超分子水凝胶触变性的影响，通过稳态剪切扫描和触变环扫描对不同组分的超分子水凝胶进行了表征。图1 所示为凝胶样品的剪切粘度随剪切速率的变化规律。凝胶样品具有剪切变稀的性质，随着剪切速率的增加，其剪切粘度迅速减小。且随α-CD浓度的增加，凝胶样品的网络结构更加致密，剪切变稀特性增强。

图2 所示为凝胶样品的触变性质表征，以含6.0% α-CD 的水凝胶样品为例：在低剪切速率（0.1 s-1）条件下，凝胶样品在测试开始阶段表现出剪切变稀的性质，10 s 之后基本达到平衡；当剪切速率增加到10 s-1时，凝胶样品的剪切粘度瞬间降低至0.48 Pa·s 左右且达到平衡，此时体系表现出良好的流动性；120 s 后，当剪切速率再次恢复到小速率0.1 s-1时，凝胶样品的粘度又迅速恢复至90 Pa·s 左右。该类凝胶体系表现出良好的触变性能，有望作为一类新型可注射药物载体得到广泛应用。

水凝胶作为药物载体，其重要优势之一在于对药物分子具有良好的控制释放和持续释放的效果[8]。图3 所示为含不同α-CD 浓度的超分子水凝胶对TC 的体外释放行为。可以看出，一系列不同配比的凝胶体系对TC 均有良好的控释效果，所有样品均没有出现明显的暴释现象，且释放过程可持续14 天以上。随着体系中α-CD 浓度的增加，超分子水凝胶的强度增大，其三维网络结构更加致密，因而对TC 的释放更加缓慢。因此，可以通过调节体系中α-CD 浓度达到合理缓释药物的目的。

图4. 大肠杆菌（a）和金黄葡萄球菌（b）在不同样品作用下的生长曲线（凝胶样品中α-CD 的浓度为6%）

图5. 凝胶样品的抑菌圈实验结果（凝胶样品中α-CD 的浓度为6%）

图4 所示为不同样品条件下大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长曲线。对于未负载药物的凝胶材料，大肠杆菌和金黄葡萄球菌均持续了7 h 的对数期后进入稳定期，与空白对照组无显著性差异。对于负载TC 的凝胶样品，其抑菌效果显著，大肠杆菌和金黄葡萄球菌在用药8 小时候均趋向于零，与纯的TC 无明显差异。在4—6 小时期间，负载TC 的凝胶样品比纯TC 的抑菌效果超差，可能是因为TC 从凝胶基质中释放出来需要一定的时间所导致。

图5 所示为载TC 的凝胶样品对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抑菌圈实验结果。结果显示，保存时间一个月的凝胶样品对两种微生物均有良好的抑菌效果，抑菌圈明显。同时，凝胶材料对金黄葡萄球菌的抑菌效果要好于大肠杆菌。因此，该抗菌水凝胶可长时间保持TC 的生物活性，在皮肤外用治疗方面具有较好的应用前景。

4.结论

以Pluronic F-88 为疏水的TC 的稳定剂，以及利用F-88 与α-CD 的相互作用，制备出一类新型的负载TC 的水凝胶材料。凝胶材料有良好的剪切变稀的性质和触变性能，可作为可注射药物载体和凝胶敷料进行应用。负载TC 的凝胶样品体现出良好的抗菌性能，对大肠杆菌和金黄葡萄球菌均有良好的抑菌效果。

[1] H. P. Schweizer, FEMS Microbiology Letters 202, 1 (2001).

[2] M. C. McBride, R. K. Malcolm, A. D. Woolfson, and S. P. Gorman, Biomaterials 30, 6739 (2009).

[3] B. A. Wilson, V. H. Smith, F. Denyelles, and C. K. Larive, Environ. Sci. Technol. 37, 1713 (2003).

[4] D. R. Orvos, D. J. Versteeg, J. Inauen, M. Capdevielle, A. Rothenstein, and V. Cunningham, Environmental Toxicology and Chemistry 21, 1338 (2012).

[5] Dong Ma, Li-Ming Zhang, Xi Xie, Tao Liu, Min-Qiang Xie. Tunable supramolecular hydrogel for in-situ encapsulation and sustained release of bioactive lysozyme. Journal of Colloid and Interface Science 2011, 359: 399-406.

[6] Dong Ma, Ting Wu, Jinglin Zhang, Minsong Lin, Wenjie Mai, Shaozao Tan, Wei Xue, Xiang Cai. Supramolecular hydrogels sustained release triclosan with controlled antibacterial activity and limited cytotoxicity. Science of Advanced Materials 2013, 5: 1400-1409.

[7] Dong Ma and Li-Ming Zhang. Supramolecular gelation of a polymeric prodrug for its encapsulation and sustained release. Biomacromolecules 2011, 12: 3124-3130.

[8] E. Josef, M. Zilberman, and H. Bianco-Peled, Acta Biomaterialia 6, 4642 (2010).